《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Functionally integrated palindromic hairpin-enabled signal efficient amplification and continuous transduction for one-pot miRNA sensing
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基于回文介导的等温级联DNA扩增与持续荧光铜纳米颗粒信号转导，本研究开发了一种高效的一步法miRNA检测新策略。通过合理设计的回文发夹（IPH）与酶协同作用，实现了目标miRNA的特异性识别、级联扩增和原位荧光信号可视化，成功检测到低至10 attomolar浓度的miRNA-155。该方法具有操作简便、灵敏度高、可扩展性强等特点，为癌症诊断等分子检测领域提供了新思路。
Jintao Chen|Yali Liu|Yuhui Shang|Yu Yang|Jinyang Chen
湖北师范大学化学与化工学院污染分析与再利用技术重点实验室，中国湖北省黄石市435002
摘要
本研究开发了一种基于回文介导的等温级联DNA扩增和连续荧光纳米信号转导的一锅法microRNA（miRNA）检测方法。通过合理的回文设计，仅需一个功能集成的回文发夹（IPH）和一对酶即可实现简化的两步miRNA检测过程。首先，目标miRNA特异性地展开IPH，然后通过回文杂交和酶促切割/聚合引发多个等温循环，完成目标识别和DNA扩增。随后，等温反应产生的大量DNA模板促进了荧光铜纳米颗粒的原位形成，实现了即时纳米信号读出。高效的等温扩增与便捷的信号转导相结合，使得miRNA-155的检测变得简单可行。此外，该方法具有高特异性和稳健性，能够通过分析细胞中的miRNA-155区分癌细胞和正常细胞。另外，只需重新设计IPH中的目标识别序列，即可用于检测其他miRNA，体现了该方法在分子诊断中的广泛应用潜力和灵活性。
引言
microRNA（miRNA）是一类进化上保守的小型非编码RNA，在转录后调控基因表达中起关键作用，可通过mRNA降解或抑制翻译来实现。[1],[2] 它们不仅是确保各种生物过程精确调控的重要介质，还参与细胞分化和免疫反应调节等关键生理功能。[3],[4],[5] 大量研究表明，miRNA表达异常与多种人类疾病（尤其是癌症、代谢综合征和心血管疾病）的进展密切相关。[6],[7],[8] 最新研究认为miRNA是重要的癌症生物标志物，因此开发高精度、高灵敏度的miRNA检测方法对于改进癌症诊断和预后评估具有重要意义。[9],[10] 常规的miRNA检测技术（如微阵列分析、Northern印迹和聚合酶链反应（PCR）已广泛应用于分子诊断和生物医学研究。[11] 其中，PCR被公认为是分子生物学和临床医学研究中精确RNA定量 的金标准方法。[12] 然而，PCR的广泛应用受到精确热循环要求、操作复杂性和仪器成本的限制，这限制了其在即时检测（如床旁检测）中的应用。这一技术空白激发了人们对等温DNA扩增技术的兴趣，因为这些技术显著提高了miRNA检测的操作简便性和适应性。[13] 常见的等温扩增技术包括环介导的等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、链置换反应（SDA）、酶辅助切割扩增（NEAA）、解旋酶依赖性扩增（HDA）以及新兴的CRISPR/Cas系统。[14],[15],[16] 尽管等温DNA扩增技术取得了显著进展，但在miRNA检测应用中平衡扩增效率与操作简便性仍具挑战性。因此，使用简单可靠的等温扩增方法实现超灵敏miRNA检测仍是精确分子诊断的理想目标。
近年来，基于生物分子的荧光金属纳米材料已成为多功能工具，既能直接将生物分子与纳米标签结合，又能促进生物传感应用中的高效纳米信号转导。[17] 在生物医学领域，银纳米簇（AgNCs）、金纳米簇（AuNCs）和铜纳米颗粒/纳米簇（CuNPs/NCs）已成为传统有机荧光团和量子点的优选替代品。[18],[19],[20] 由于具有合成简单、形成快速、成本低廉、毒性低和生物相容性优异等优点，荧光CuNPs/NCs成为诊断和传感平台中传统荧光探针的有希望的替代品。[21],[22] 除了这些通用优势外，DNA模板化的CuNPs（DNA-CuNPs）还具有独特特性，如制备时间少于5分钟、斯托克斯位移大于230纳米以及强烈的模板依赖性。[23],[24],[25] 此外，其合成后的特性解决了传统荧光标记方法中信号背景比低的问题，从而提高了检测灵敏度。基于DNA-CuNPs的传感器在离子、小分子、大分子和细胞等多种目标上展示了出色的分析能力。[26],[27],[28],[29],[30],[31] 但其在生化传感中的实际应用仍处于早期发展阶段。进一步探索和扩展其传感应用至关重要。因此，将基于DNA-CuNP的信号读出与等温扩增相结合，将大大提升miRNA的精确无标记检测能力，推动荧光纳米传感和精准分子诊断的发展。
基于以上考虑，本研究开发了一种利用回文介导的等温级联DNA扩增和原位纳米信号转导的超灵敏miRNA检测方法。得益于合理的回文设计，该检测系统操作简便，仅需一个精心设计的发夹和两种酶即可完成两步miRNA检测。第一步中，特异性目标识别触发等温级联信号扩增；随后，快速原位合成荧光DNA-CuNPs实现无标记信号输出。高效等温扩增与连续信号转导的结合，使得miRNA-155的检测变得简单高效。实验表明，该方法可通过检测细胞中的miRNA-155准确区分癌细胞和正常细胞。此外，通过修改发夹序列，该检测方法还可用于检测其他miRNA，展现了其在分子诊断中的广泛适用性和潜力。
材料与设备
表S1（支持信息）中列出的所有寡核苷酸的定制合成和HPLC纯化工作由Sangon Biotechnology Co. Ltd.（中国上海）完成。Klenow片段（KF, 3′→5′ exo?）和脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合物购自Sangon Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。抗坏血酸钠（SA）和五水合硫酸铜（CuSO4·5H2O）由Sigma Aldrich（美国）提供。Nt.BbvCI酶及其相关试剂也由该公司提供。
miRNA检测的设计原理
IPH序列的设计对检测效果至关重要。如图1A所示，IPH采用茎环结构，包含目标识别序列、切割位点、多腺苷/胸腺嘧啶（poly-AT）段以及两端的回文序列（Palindrome-1和Palindrome-2）。miRNA检测通过简化的两步流程完成，具体操作过程和原理见图1B。
结论
总之，本研究开发了一种易于使用的超灵敏miRNA检测方法，该方法结合了等温级联DNA扩增和连续荧光信号转导技术。通过合理的双端回文设计和协同催化作用，该系统仅需一个精心设计的发夹和两种酶即可实现miRNA-155的一锅检测，成功实现了扩增效率与操作简便性的平衡。
作者贡献声明
Jintao Chen：撰写初稿、方法设计、数据整理、概念构建。Yali Liu：软件开发、数据分析。Yuhui Shang：方法设计、数据整理。Yu Yang：验证、数据整理。Jinyang Chen：撰写修订稿、监督工作、资源协调、项目管理和资金争取。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22004031）和湖北省自然科学基金（项目编号：2023AFB996）的支持。
