反复暴露于芳樟醇氢过氧化物诱导免疫学证实的变应性接触性皮炎

《Contact Dermatitis》：Repeated Exposure to Hydroperoxides of Linalool Induces Immunologically Verified Allergic Contact Dermatitis

本研究通过重复开放应用试验（ROAT）评估芳樟醇氢过氧化物（Lin-OOH）的激发阈值，并探究其相关免疫应答，确认了Lin-OOH在致敏个体中可引起剂量依赖性皮肤反应，并揭示了IL1家族、2型免疫反应和趋化因子的上调模式，为理解香料变应性接触性皮炎（CA）的机制提供了分子水平证据。

　　

引言

香料过敏原是变应性接触性皮炎（CA）的第二大常见诱因。芳樟醇（linalool）是化妆品和家居用品中最常用的香料物质之一，但其本身致敏性弱，属于前致敏原（prehapten）。当芳樟醇暴露于空气中时，会通过自氧化作用形成具有强烈皮肤致敏作用的芳樟醇氢过氧化物（Lin-OOH），其中Lin-6/7-OOH是主要的致敏成分。斑贴试验（patch test）研究显示，对Lin-OOH的阳性反应率较高（3.9%–11.7%），但结果中也常出现可疑或刺激性反应，变异性较大。重复开放应用试验（ROAT）是一种模拟日常接触的标准化试验方法，可用于辅助诊断或验证斑贴试验结果。本研究旨在（1）重新评估Lin-OOH的斑贴试验浓度；（2）确定其在每日暴露下的激发阈值；（3）深入了解皮肤对Lin-OOH的免疫学反应。

方法

2.1 试验材料

使用从Chemotechnique Diagnostics获得的纯Lin-OOH（16.3%），并在80%乙醇/水（80:20 v/v）的媒介中制备预定的斑贴试验和ROAT浓度。斑贴试验浓度包括2%、1%、0.5%、0.25%、0.125% Lin-OOH及媒介对照；ROAT溶液包含0.163%（1630 ppm）、0.054%（538 ppm）和0.018%（179 ppm）Lin-OOH及媒介对照。

2.2 参与者

研究纳入了12名经斑贴试验证实对Lin-OOH 1.0%呈阳性反应的CA患者（年龄38-68岁）和20名健康对照者（年龄23-63岁）。所有参与者均签署知情同意书。

2.3 确认性斑贴试验

在ROAT开始前，对致敏患者和健康对照者进行了Lin-OOH系列稀释液的斑贴试验以确认免疫状态。使用芬兰小室（Finn Chambers）并依据欧洲接触性皮炎学会（ESCD）指南进行操作。

2.4 皮肤活检

在部分同意参与者中，于斑贴试验第3天采集3 mm皮肤活检样本，冷冻保存。通过RT-qPCR分析免疫相关基因的表达，基因表达以EEF1A1为内参进行归一化。

2.5 ROAT设备与程序

参与者收到装有颜色编码Lin-OOH溶液的ROAT试剂盒。致敏患者暴露于三种浓度的Lin-OOH及一种媒介对照，健康对照者仅暴露于最高浓度（0.163%）及媒介对照。将25 μL测试溶液每日两次涂抹于前臂3×3 cm的标准区域。试验对参与者和研究者设盲。皮肤反应根据“改良ROAT评分量表”进行评估，并在第7、14、21天或出现反应时进行记录。

2.6 统计分析

使用GraphPad Prism和Microsoft Excel进行数据分析。采用费希尔精确检验比较致敏患者与健康对照者的阳性反应比例。p值<0.05被认为具有统计学显著性。

结果

3.1 MOAHLFA指数

在致敏患者中，特应性皮炎（58%）和手部湿疹（75%）患病率较高，面部/颈部湿疹（83%）和40岁以上（83%）患者占多数。

3.2 斑贴试验结果

在患者队列中，1% Lin-OOH稀释液在所有患者（12/12）中均引发明确的阳性反应。而标准的1% Lin-OOH凡士林制剂在11/12患者中引发明确阳性反应，1例为可疑反应。较低浓度（0.125%、0.25%、0.5%）的阳性反应率呈剂量依赖性下降。在健康对照者中，有4例因对1.0% Lin-OOH呈阳性或可疑反应而被排除。

3.3 ROAT结果

在ROAT期间，4/12（33%）的致敏患者对最高浓度（0.163% Lin-OOH）产生阳性反应；2/12（17%）对中等浓度（0.054%）产生反应；1/12（8%）甚至对最低浓度（0.018%）产生反应。所有阳性反应患者均为女性，并将化妆品报告为其湿疹的主要诱因。所有致敏患者均报告了局部或全身性瘙痒，而20名健康对照者均未出现任何反应或瘙痒，两组间阳性反应比例差异具有统计学显著性（p=0.0242）。

3.4 免疫学皮肤反应

对部分活检样本的RT-qPCR分析显示，与健康对照相比，致敏患者的皮肤在接触Lin-OOH后，呈现出清晰的免疫基因表达趋势。具体表现为IL1家族基因（IL1β, IL1RN）、促炎细胞因子（IL8）、2型免疫反应相关基因（IL4和GATA3）、T细胞活化标志物（IL2RA）以及趋化因子CCL22的上调。

讨论

本研究患者群体以40岁以上女性为主，这与既往研究一致。特应性皮炎和手部湿疹的高共病率支持了这些疾病之间的重叠。研究发现，1% Lin-OOH是确认接触过敏的最合适的斑贴试验浓度。值得注意的是，4名健康对照者对1% Lin-OOH产生反应，提示对Lin-OOH的CA可能存在漏诊。

ROAT结果表明，在致敏个体中，不存在Lin-OOH暴露的安全阈值，反应呈剂量依赖性。更早、更强的ROAT反应与斑贴试验强度相关，表明存在一个高度敏感的亚组。与使用霜剂媒介的类似研究相比，本研究中乙醇基媒介可能影响了皮肤渗透和致敏潜力。

本研究中，最低ROAT剂量（每次应用0.5 μg/cm²Lin-OOH）仍在一名患者中诱发了ACD，这低于先前报道的ED₁₀值（0.835 μg/cm²）。产品中Lin-OOH的浓度范围很广，从洗护用品中的微量到须后水中的高浓度均有，凸显了使用LC/ESI-MS/MS等灵敏技术进行检测的必要性。

免疫学分析揭示了与变应性接触性皮炎一致的基因表达模式，包括2型反应和炎症介质的上调。所有致敏患者在ROAT期间均报告了瘙痒（即使无可见皮疹），这支持了在2型炎症中，细胞因子可能直接激活感觉神经元导致瘙痒先于皮炎的假说。本研究的一个局限是样本量相对较小。

结论

这项实验研究表明，Lin-OOH在致敏患者中能引起剂量依赖性反应，无论是斑贴试验还是模拟使用条件（ROAT）下，而健康对照者无反应，从而证实了其作为接触性过敏原的性质。基因表达分析揭示了与香料CA相一致的免疫应答通路的上调，为了解其潜在的免疫学机制提供了宝贵的见解。这些发现可能有助于改进香料诱发CA的诊断、预防和管理策略。