《HemaSphere》：Wnt-dependent spatiotemporal reprogramming of bone marrow niches drives fibrosis
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本期推荐文章深入探讨了骨髓纤维化（BM fibrosis）这一复杂病理过程的细胞与分子机制。作者创新性地结合谱系示踪、单细胞测序（scRNAseq）和三维成像技术，揭示了骨髓不同空间微环境（如血管周围CXCL12-abundant reticular (CAR)细胞和骨小梁周围成骨谱系细胞OLCs）在纤维化诱导性造血细胞刺激下的动态重编程过程。研究首次明确了骨小梁周围间充质祖细胞（OLC3）作为纤维化驱动细胞库的关键作用，其Wnt/β-catenin信号通路依赖性激活是导致纤维化和骨硬化（osteosclerosis）的核心机制。更令人振奋的是，研究通过抑制Wnt信号通路，成功在小鼠模型中减轻了纤维化和骨硬化，为原发性骨髓纤维化（PMF）等疾病的治疗提供了新的潜在靶点。该工作不仅深化了对骨髓纤维化时空演进的理解，也为开发靶向骨髓微环境的抗纤维化疗法奠定了坚实的理论基础。
骨髓纤维化是骨髓微环境最广泛的基质重塑，可伴随新生骨形成（骨硬化）。然而，关于不同骨髓龛细胞群体在此过程中贡献的时空信息尚不完整。本研究揭示了纤维化诱导性造血细胞会导致血管周围CXCL12丰富网状细胞（CAR细胞）发生促纤维化重编程，导致其造血支持功能丧失，并上调成骨和促凋亡程序。与此同时，骨小梁周围的成骨谱系细胞（OLCs）以一种类似于骨骼修复的、损伤特异性的、Wnt依赖的方式被激活。
为了在稳态和纤维化条件下高分辨率解析骨髓基质区室，研究使用了三种不同的谱系示踪基质Cre报告小鼠：泛间充质标记物Pdgfrb-CreERT2、在血管周围和骨内膜均有分布的Gli1-CreERT2、以及标记成骨谱系基质细胞的Grem1-CreERT2。结合全骨髓三维成像和单细胞RNA测序，研究成功捕获了骨髓内不同空间宏观龛（干骺端和骨干）的基质细胞组成。在稳态下，Pdgfrb报告细胞广泛分布于骨髓各处；Gli1报告细胞主要位于干骺端的骨小梁周围区域以及骨干的中央动脉周围；而Grem1报告细胞则最少，主要见于生长板的软骨细胞柱。
当通过移植过表达血小板生成素（TPO-OE）的造血干祖细胞诱导骨髓纤维化后，基质细胞发生了显著变化。单细胞测序显示，在纤维化条件下，所有CAR细胞群的比例均下降，而成纤维细胞（FBs）、OLCs和软骨细胞样细胞在分选的tdTom+细胞中被富集。值得注意的是，成纤维细胞在纤维化中大量扩增，并高表达Ly6a（Sca-1）。利用Ly6a-GFP报告小鼠验证发现，在纤维化骨髓中，Ly6a-GFP+且不表达内皮标记物endomucin的成纤维细胞在中央骨髓中大量扩增。CAR细胞（特别是CAR1）则获得了促纤维化表型，上调了胶原（如Col1a1, Col3a1）和细胞外基质重塑基因（如Mmp2, Mmp9）的表达，同时其造血支持基因（如Cxcl12, Kitl）表达下降。
空间成像分析揭示了纤维化转化过程中干骺端和骨干区域的 distinct 基质表型转换。所有Cre报告细胞的tdTom+细胞激活热点均在干骺端区域。其中，Gli1+基质细胞表现出两种 distinct 的激活模式：在干骺端骨内膜区域频率增加并 expansion；在骨干则从血管周 detachment，细胞变大并获得活化的肌成纤维细胞样形态。时间进程实验显示，Gli1+细胞以逐步方式从干骺端骨小梁激活并扩增进入中央骨髓。重要的是，纤维沉积（网状蛋白）的热点完全与干骺端tdTom+细胞的热点区域重合，表明位于干骺端的损伤特异性基质群体对纤维化转化至关重要。
进一步的分析聚焦于成骨谱系细胞OLCs。轨迹分析和细胞周期状态评估表明，OLC3细胞扮演着中央枢纽的角色，连接CAR细胞、前软骨/软骨细胞和成纤维细胞，并具有祖细胞特性。在纤维化条件下，OLC3和pre-chondro细胞的G2期比例显著增加，表明其对组织损伤的增殖反应。轨迹分析揭示了OLC3向三个方向分化的潜势：通过CAR1/3/5、OLC1/2/3向成熟成骨细胞（“成骨倾向轨迹”）；通过OLC3向软骨细胞（“软骨倾向轨迹”）；以及通过OLC3向成纤维细胞（“成纤维细胞倾向轨迹”）。在纤维化中，向成纤维细胞的分化增加，解释了其在骨髓中的丰度。
功能实验证实了干骺端（骨小梁周围）区域富含基质祖细胞。从稳态小鼠长骨干骺端分选出的Pdgfrb+或Gli1+细胞具有体外形成成纤维细胞集落（CFU-F）的能力，而从同一骨骼的骨干分选的同类细胞则无此能力。在纤维化背景下，基质干/祖细胞的分化发生偏移。组织学分析和定量显示，纤维化骨髓中脂肪细胞面积和数量显著减少，而 microCT 分析证实了骨量、骨小梁数量和连接性的增加，即骨硬化。单细胞数据也显示，CAR细胞和OLC3在纤维化中显著下调了脂肪生成基因的表达，而CAR细胞则上调了成骨基因。
研究将NCAM1（CD56）鉴定为OLCs的标志物。在对照条件下，NCAM1+细胞特异地定位于生长板下方和骨小梁周围。在纤维化中，NCAM1+细胞从骨小梁周围显著扩增，并与增殖标志物Ki67共定位。流式细胞术证实，纤维化骨髓中NCAM1+OLCs比例增加，而VCAM1+CARs减少。在人类原发性骨髓纤维化（PMF）患者活检中，NCAM1+细胞的总体积和其向中央骨髓（骨小梁间空间）的 expansion 也显著增加，并且与纤维化程度（CIF评分）相关。
机制上，细胞-细胞互作分析发现OLC3中富含Wnt通路信号。在纤维化条件下，OLC3和CAR细胞中Wnt通路胞内信号转导子β-catenin（Ctnnb1）的表达显著上调，而Wnt抑制剂Sfrp1和Sfrp4的表达下降。免疫荧光证实，在纤维化骨髓中，扩增的Gli1+细胞内β-catenin表达增加。在患者样本中，随着纤维化进展，基质细胞的β-catenin表达（基质β-catenin分级，s-bCG）也显著增加。
基于上述发现，研究评估了靶向Wnt信号通路的治疗潜力。利用FDA批准的药物pyrvinium-tosylate（PT）——一种通过激活casein kinase 1α（CK1α）来促进β-catenin降解的Wnt抑制剂——在纤维化小鼠模型中进行治疗。PT治疗显著降低了网状蛋白纤维化分级，并改善了脾脏病理。单细胞测序显示，PT处理主要影响了基质细胞（如CAR细胞），上调了Wnt抑制剂Sfrp1和Sfrp4的表达，下调了Col1a1的表达，并使偏移的基质分化（软骨/成骨基因集上调，脂肪基因集下调）恢复正常。NCAM1+细胞的扩增也在PT治疗后显著减少。空间转录组学进一步证实，PT治疗降低了纤维化骨髓中与巨核细胞、成纤维细胞、内皮细胞及CAR细胞相关的空间域内的胶原、Wnt通路、软骨和成骨基因的表达。
综上所述，本研究描绘了骨髓纤维化过程中骨髓微环境时空重编程的精细图谱：损伤始于中央血管周围龛，CAR细胞被重编程并功能耗竭；继而通过内皮变化等信号，激活干骺端骨小梁周围的间充质祖细胞（OLC3）。这些细胞以Wnt依赖性方式扩增，并偏向分化为成骨细胞和促炎性成纤维细胞，共同驱动骨硬化和骨髓纤维化。靶向Wnt信号通路可有效抑制这一过程，为骨髓纤维化的治疗提供了新的策略。
