编辑推荐：
这篇回顾性研究评估了OCT3/4反射检测在男性不育睾丸活检中的应用价值。研究发现，原位生殖细胞肿瘤（GCNIS）的检出率为1.4%，其中0.2%为间质型精原细胞瘤。研究提示，对于有生殖细胞肿瘤（GCT）病史或临床怀疑的患者，OCT3/4检测能显著提升GCNIS的诊断率，而精子发生水平（Johnsen评分）与GCNIS检出无显著关联。
引言
睾丸癌是欧洲和北美15-44岁男性中最常见的恶性肿瘤，其发病率持续上升。精原细胞瘤和非精原细胞瘤作为最常见的睾丸生殖细胞肿瘤（GCT），均起源于共同的前体——原位生殖细胞肿瘤（GCNIS）。男性不育已被确定为睾丸癌的重要风险因素，不育男性患GCT的风险最高可增加三倍。因此，在不育活检标本中检测隐匿性睾丸GCT至关重要，理想情况下应在浸润前阶段发现。由于50%的GCNIS患者可能在5年内发展为浸润性睾丸癌，早期识别旨在减少延迟诊断和管理的影响。
仅凭组织学诊断GCNIS仍具挑战性：它可能因非典型生殖细胞的局灶性存在而被漏诊，也可能因隐睾、不育或性发育异常患者中多倍体化导致的萎缩小管内深染精原细胞而被过度诊断。免疫组化通过OCT3/4、CD117、podoplanin和PLAP等标记物在确认或排除肿瘤细胞方面具有重要附加价值。OCT3/4因其在肿瘤细胞中强烈的核免疫反应性，且在福尔马林固定组织中背景染色极少而常被优先选用。辅助性免疫组化常用于在因GCT行睾丸切除术时同时进行的对侧睾丸活检中识别或排除GCNIS。然而，对于在不育诊断和治疗中获取的睾丸活检中GCNIS的存在情况及反射性免疫组化检测的附加价值知之甚少。本研究的目的为：（i）在大量男性不育活检中确定OCT3/4反射检测的诊断效能；（ii）在此背景下将临床病理特征与GCNIS发现相关联。
方法
研究队列
这项回顾性研究纳入了2010年至2025年间在荷兰鹿特丹Erasmus MC大学医院（一家为男性不育和精子冷冻保存提供专科护理的教学医院）接受睾丸活检的男性患者（>16岁）。通过病理实验室医学系统（LMS）搜索确定患者。外部会诊病例被排除。睾丸活检的临床指征是评估精子发生和排除GCNIS。该项目获得了Erasmus MC医学伦理委员会的批准（MEC-2025-0090）。
手术技术与临床数据
在镇静镇痛下，通过阴囊切口获取至少0.2 × 0.2 × 0.2 cm的开放性睾丸活检组织，优选双侧分别取样。对于临床无精子症且有生育需求的男性，在活检的同时进行睾丸精子提取（TESE）以冷冻保存精子。将有对侧GCT病史或怀疑患有GCT（无论是另一侧睾丸还是睾丸外部位）的患者归为“关注GCT”亚组。从病历中检索出诊断为GCNIS的患者的相关随访数据。
病理学评估
睾丸标本用福尔马林固定，操作轻柔以避免组织损伤。标本全部包埋于石蜡中。选择福尔马林而非Bouin氏液是为了允许更敏感的免疫组化检测并与标准实验室流程保持一致。切取4或5 μm厚的组织切片进行苏木精-伊红（H&E）染色。所有样本在诊断时均通过反射检测常规进行OCT3/4免疫组化（MRQ-10克隆；Bench Mark Ultra系统）；这意味着实验室对所有病例都进行了检测，病理医生同时收到H&E和OCT3/4切片，无需二次申请OCT3/4检测。不育活检由泌尿病理医生处理，其根据Johnsen评分报告精子发生水平并评估GCNIS的存在。正常精子发生定义为Johnsen评分≥8，此时生精小管可见成熟精子。病理数据来自病理报告，本研究回顾了选定病例的切片。
统计分析
分类变量和连续变量分别使用卡方检验和独立t检验进行比较。P值<0.05被认为具有统计学意义。统计分析使用SPSS Statistics版本28.0.1.0 (142)进行。
结果
患者特征
在15年期间，分析了来自1870名男性的3353份睾丸不育活检标本，每年活检中位数为136份（四分位距[IQR] 101–172）。患者中位年龄为34岁（IQR 30–38）。大多数患者同时接受了TESE（1054/1087名男性；97.0%），1870名男性中有1483名（79.3%）接受了双侧取样。当仅在TESE过程中评估一侧的GCNIS和精子发生，或因先前对侧睾丸切除术后仅剩单侧睾丸，或因超声检查发现异常仅取一侧睾丸时，从387名患者（20.7%）获取了单侧样本。
绝大多数男性（1714/1870；91.7%）不关注GCT，而156名（8.3%）关注GCT。后者包括79名（4.2%）有对侧GCT根治性睾丸切除术病史的患者，47名（2.5%）同时因GCT接受对侧根治性睾丸切除术的患者，18名（1.0%）出现超声可见睾丸肿块的患者和12名（0.6%）有性腺外GCT病史的患者。关注GCT的患者中，105/156例（67.3%）进行了单侧取样，51/156例（32.7%）进行了双侧取样。不关注GCT的患者中，282/1714例（16.5%）进行了单侧取样，1432/1714例（83.5%）进行了双侧取样。
精子发生
在2277/3343份活检（68.1%，除10份活检无可分析的足够实质外）中精子发生异常，Johnsen评分中位数为4（IQR 1–7）。1066份样本（31.9%）存在精子（Johnsen评分8–10）。715份活检（21.4%）精子发生减少（Johnsen评分4–7），1562份活检（46.7%）无精子发生（Johnsen评分1–3）。发现4例（0.1%）肉芽肿性炎症。
GCNIS的存在
OCT3/4免疫组化显示，来自42/1870名男性（2.2%）的48/3353份睾丸活检（1.4%）中存在GCNIS。GCNIS在36/48份活检（75.0%）中为单侧存在，在12/48份活检（25.0%）中为双侧存在。大多数GCNIS患者不关注GCT（27/42；64.3%），这相当于非怀疑男性中GCNIS的发生率为1.6%（27/1714）。
未受累的生精小管大多未显示正常精子发生（33/48份活检，68.7%），而15/48份活检（31.3%）发现了正常精子发生。在一些样本中（10/48份活检，20.8%），GCNIS被发现存在于具有成熟精子发生的生精小管内（图2）。GCNIS在27份活检（56.3%）中呈局灶性存在，在21份活检（43.7%）中呈弥漫性存在（受累生精小管少于或多于50%）（图3）。
在3名男性中，发现间质型生长模式的精原细胞瘤与GCNIS相邻，其中两人不关注GCT。在这些病例中，模式非常细微，仅见少数散在的非典型生殖细胞分布在生精小管之间（图4）。补充材料1提供了GCNIS和浸润性精原细胞瘤男性的临床病理特征详细描述。
临床病理风险因素
患有GCNIS的男性（32.4岁 [标准差 6.1]）比未患GCNIS者（35.4岁 [标准差 8.0]）略为年轻（P = 0.015）。关注GCT的患者（15/156，9.6%）比不关注GCT的患者（27/1714，1.6%）更可能患有GCNIS（P < 0.001）。患有GCNIS的患者更常进行单侧取样（14/387，3.6%），而非双侧取样（28/1483，1.9%）（P = 0.041）。根据是否关注GCT及取样方式，GCNIS的检出率具有统计学差异：关注GCT且单侧取样（11/105，10.5%），关注GCT且双侧取样（4/51，7.8%），不关注GCT且单侧取样（3/282，1.1%）和不关注GCT且双侧取样（24/1432，1.7%）（P < 0.001）（图1）。在“关注GCT”亚组内（P = 0.600）或无GCT关注的组内（P = 0.450），单侧与双侧取样之间的GCNIS检出率均无统计学差异。不同Johnsen评分组之间的GCNIS患病率无统计学差异（P = 0.277）：无精子发生 24/1562（1.5%）；精子发生减少 9/715（1.3%）；正常精子发生 15/1066（1.4%）。
临床结局
可获得40名活检阳性男性的临床管理信息。32/40名患者（80.0%）进行了根治性睾丸切除术，8/40名患者（20.0%）接受了放射治疗。在12/31名患者（38.7%）的根治性睾丸切除术中发现了浸润性精原细胞瘤（大小0.5–2.5 cm），1名患者在外部机构接受了手术。根治性睾丸切除术在本机构进行，中位间隔时间为活检后3个月（IQR 1–5个月）。根据美国癌症联合委员会（AJCC）第8版分期，根治性睾丸切除术时的病理分期为：12名精原细胞瘤患者为pT1，18名GCNIS患者为pTis，1名患者为ypT0（补充材料1）。后者（病例#32）因伴发对侧绒毛膜癌正在接受化疗。活检的睾丸在6个月后的根治性睾丸切除术中未发现残留肿瘤（ypT0）。所有根治性睾丸切除术切缘均无肿瘤。本队列包括两例复发；病例#15最初接受根治性睾丸切除术（pT1），7年后出现淋巴结转移；病例#28有对侧精原细胞瘤病史，最初因孤立睾丸中的GCNIS接受放射治疗，10年后出现淋巴结转移。
讨论
在这项包含超过3000份睾丸活检并常规进行OCT3/4免疫组化的研究中，我们发现1.4%的病例存在GCNIS，0.2%存在隐匿性浸润性精原细胞瘤。关注GCT的男性被诊断为GCNIS的风险高6倍（9.6%）。患有GCNIS的患者在Johnsen评分上的精子发生水平无差异。三分之一的GCNIS男性具有正常精子发生（Johnsen评分8–10），64.3%不关注GCT。尽管发现早期GCNIS甚至浸润性精原细胞瘤较为罕见，但其诊断对这些年轻男性的临床管理产生了重大影响，其中两人（5%）尽管接受了针对初始GCNIS的治疗，仍出现了淋巴结复发。
本研究中发现的GCNIS检出率（42/1870名患者，2.2%）与其他小组发现的平均2%一致。存在一定变异性，因为研究纳入或未纳入关注GCT的患者，检出率从0/207（0%）无既往睾丸癌史的患者到10/158（6.3%）后来被诊断为睾丸癌的患者不等。在本研究中，我们选择呈现真实世界的实践，纳入了所有连续患者，其中8.3%关注GCT。不同的检出率也可用历史偏倚解释，因为我们的检出率略高于先前较旧的研究（2000年前为0–1%），这可能是由于当时免疫组化使用有限。确实，较早的研究更常使用H&E染色，伴或不伴PAS染色，偶尔使用PLAP免疫组化。这与OCT3/4在千禧年之后被发现和使用相一致。据我们所知，尚无其他研究报告像本研究这样前瞻性常规使用OCT3/4于生育力活检。
GCNIS和浸润性精原细胞瘤的诊断对临床管理有直接且重大的影响。根据欧洲泌尿外科协会（EAU）指南，大多数患者（80%）进行了根治性睾丸切除术，而其余20%的患者接受了局部放疗，旨在治愈GCNIS的同时保留Leydig细胞功能。关于活检检测到的GCNIS的临床管理证据很少。EAU指南推荐睾丸切除术或密切观察，而对于孤立睾丸应考虑放疗。已知后者的失败率非常低，为1%。在我们的队列中，两名患者在初始治疗后7年和10年发生了长期淋巴结复发。病例#15曾接受根治性睾丸切除术，病例#28选择了放射治疗。两者在活检时均被证实除GCNIS外还有浸润性精原细胞瘤；病例#15在根治性睾丸切除术时有浸润性精原细胞瘤，病例#28有对侧精原细胞瘤病史。因此，尚不确定复发是与活检检测到的GCNIS、浸润性精原细胞瘤相关，还是与两者均相关。
我们的研究强调了OCT3/4作为诊断不育活检中GCNIS工具的价值。鉴于每份活检的GCNIS总检出率仅为1.4%，在所有机构中对所有睾丸活检常规使用反射检测可能不可行或不具成本效益。然而，基于本研究结果，我们推荐一种更有针对性的OCT3/4检测方法，特别关注关注GCT的患者。该亚组的GCNIS检出风险显著更高，OCT3/4检测更可能有用。然而，在关注GCT的患者亚组中，单侧与双侧取样在GCNIS率上未显示出统计学差异：单侧取样患者为10.5%，双侧取样患者为7.8%。因此，取样方式不能作为选择进行OCT3/4检测患者的区分依据。
通过使用OCT3/4作为筛查工具，我们认为可以避免进一步的假阴性。我们研究中一个有趣的发现是，GCNIS检出率在不同Johnsen评分精子发生亚组之间无显著差异。据我们所知，这似乎与已发表文献相悖，后者报道精子发生不良和少精子症是GCNIS的风险因素。因此，我们认为在完全由因不育原因接受睾丸活检的患者组成的队列中，该风险因素变得不那么显著；然而，可能需要进一步研究来证明这一假设。
此外，我们建议仔细评估显示成熟精子发生（Johnsen评分≥8）的生精小管，其中20.8%含有GCNIS的活检中发现GCNIS与其共存，OCT3/4对此有帮助（图2）。这一发现通常被认为罕见，因为GCNIS通常被描述为典型地存在于无精子发生的生精小管中。然而，已知GCNIS可能与正常的生殖细胞在生精小管内混合存在。我们的研究表明，共存GCNIS和成熟精子发生可能比通常认为的更频繁。因此，在未怀疑GCNIS的情况下，OCT3/4可以成为一个优势。此外，OCT3/4有助于诊断局灶性GCNIS、细微的间质型精原细胞瘤，并有助于解释福尔马林固定活检的伪影（图3和图4）。确实，在我们的研究中，少数GCNIS病例（3/42，7.1%）在活检中检测出隐匿性间质型精原细胞瘤。鉴于间质型精原细胞瘤的不显眼模式，OCT3/4将有助于检测这一罕见但先前有记载的发现。因此，这种选择性但审慎的方法可能会提高这一高危男性人群中癌前病变和恶性病变的诊断效能，同时仍认识到GCNIS总体发生率相对较低。
本研究因其回顾性设计存在一些局限性。病例未经重新审阅，反映了真实世界的实践，即病理医生依赖于现有的临床信息和组织学发现。因此，风险因素和临床数据仅限于提供的信息，这可能并不总是完整的。所以，“不关注GCT”亚组中的一些隐匿性GCNIS病例若有完整的临床数据可能已被怀疑。一些患者的外部管理也限制了临床数据和随访的获取。最后，未记录单独基于H&E对GCNIS的组织学怀疑，因此无法评估OCT3/4在形态学上不明显的活检中的确切附加价值。
结论
在睾丸活检中进行OCT3/4反射检测，在1.4%的活检（源自2.2%的患者）中检测出GCNIS，同时在0.2%的活检中发现了细微的间质型精原细胞瘤。我们建议在关注GCT的男性中常规进行OCT3/4染色。在没有临床风险因素的非怀疑男性中，无论精子发生水平如何，GCNIS的风险均<2%。
资金来源声明
本研究未获得任何资助。
利益冲突声明
作者声明无利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。由于隐私或伦理限制，数据不公开提供。
