IMPDH抑制剂通过耗竭鸟苷酸在表达SAMHD1的白血病细胞中增强阿糖胞苷疗效

《Molecular Oncology》：IMPDH inhibition enhances cytarabine efficacy in SAMHD1-expressing leukaemia cells via guanine nucleotide depletion

这篇综述深入探讨了在急性髓系白血病（AML）治疗中，靶向核苷酸代谢以克服由dNTP三磷酸水解酶SAMHD1介导的阿糖胞苷（ara-C）耐药性的新策略。研究通过筛选靶向核苷酸生物合成酶的化合物，发现抑制鸟嘌呤核苷酸合成限速酶IMPDH的已批准药物霉酚酸（MPA）和利巴韦林（RBV），可特异性在表达SAMHD1的白血病细胞中，通过耗竭dGTP、扰动dNTP池，从而抑制SAMHD1对活性代谢物ara-CTP的水解，最终增强ara-C诱导的DNA损伤和细胞凋亡。这为利用现有药物间接靶向SAMHD1、改善AML的ara-C疗法提供了新的见解和潜在的临床转化途径。

　　

¹IMPDH抑制在表达SAMHD1的白血病细胞中增强阿糖胞苷疗效的机制探究

阿糖胞苷（cytarabine, ara-C）是急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukaemia, AML）标准治疗方案的核心组成部分。其疗效依赖于在细胞内磷酸化生成活性三磷酸代谢物ara-CTP，后者被错误掺入基因组DNA，引发DNA损伤和细胞凋亡。然而，脱氧核糖核苷三磷酸三磷酸水解酶（deoxyribonucleoside triphosphate triphosphohydrolase, dNTPase）SAMHD1能够水解ara-CTP，将其转化回无活性的前药形式，从而构成治疗有效性的一个重要屏障。因此，开发靶向SAMHD1的策略至关重要。

SAMHD1的酶活性受核苷酸的变构调节，而核苷酸在细胞中通过不同途径合成。本研究通过筛选一系列靶向核苷酸生物合成酶的药物，发现抑制鸟嘌呤核苷酸生物合成限速步骤的关键酶——肌苷-5′-单磷酸脱氢酶（inosine-5′-monophosphate dehydrogenase, IMPDH），能够以SAMHD1依赖的方式，使AML细胞系对ara-C增敏。研究证实，已获批的IMPDH抑制剂——霉酚酸（mycophenolic acid, MPA）和利巴韦林（ribavirin, RBV）——能够扰动脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP）池的平衡，并在SAMHD1充足而非缺失的白血病细胞中增强ara-C的疗效。

²聚焦药物组合筛选鉴定IMPDH抑制剂为SAMHD1充足白血病细胞中的阿糖胞苷增敏剂

为了探究是否其他dNTP池扰动也能影响SAMHD1活性，并可能发现正交的SAMHD1靶向策略，研究团队编译了一组抑制嘌呤和嘧啶^{de novo}合成不同步骤的化合物库。在多个SAMHD1充足和缺失的细胞系对中，通过增殖抑制实验评估它们与ara-C联用能否产生SAMHD1依赖的协同效应。

de novo合成途径。粉色为筛选化合物，蓝色为其靶向酶。(B) SAMHD1充足和缺失细胞系面板的免疫印迹分析。(C) 筛选流程示意图。">

研究以核糖核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase, RNR）抑制剂羟基脲（hydroxyurea, HU）作为阳性对照。在THP-1细胞系对中，HU与ara-C联用始终在SAMHD1充足模型中产生协同作用，而在SAMHD1缺失对应细胞中显著减弱为近加和效应。在化合物库中，只有两种化学结构不同的IMPDH抑制剂——MPA和RBV，能够引发与ara-C的SAMHD1依赖性药物组合效应。这种SAMHD1依赖的ara-C增敏在THP-1细胞系对中最为显著。而靶向腺苷酸琥珀酸合成酶（adenylosuccinate synthetase, ADSS）或嘧啶核苷酸生物合成的化合物，均未产生一致的SAMHD1依赖性协同作用。该筛选结果确定IMPDH抑制剂是另一类能够引发与ara-C的SAMHD1依赖性协同作用的化合物。

+/+或SAMHD1^?/?THP-1细胞中，阿糖胞苷与所示核苷酸生物合成抑制剂的药物协同图。(B) 在SAMHD1^+/+或^?/?THP-1细胞中，阿糖胞苷与IMPDH抑制剂或HU联合治疗的增殖抑制分析。">

³IMPDH抑制剂MPA和利巴韦林不直接抑制SAMHD1 dNTPase活性

为探究MPA和RBV与ara-C之间SAMHD1依赖性药物相互作用的机制，研究首先排除了两者直接抑制SAMHD1活性的可能性。在酶偶联活性实验中，即使浓度高达500 μM，MPA和RBV也未改变SAMHD1对dGTP的水解，而阳性对照洛莫芬金（lomofungin）则呈现剂量依赖性抑制。

随后，通过细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）评估药物代谢物是否会与SAMHD1相互作用或扰动其蛋白稳定性。与阳性对照胸苷（thymidine）处理增加SAMHD1热稳定性不同，用MPA和RBV处理的细胞表现出SAMHD1热稳定性降低。这些数据表明，MPA和RBV不直接抑制SAMHD1活性，但以不同于核苷酸配体的方式影响细胞内SAMHD1的蛋白稳定性。

⁴IMPDH抑制剂MPA和利巴韦林耗竭白血病细胞中的dGTP池并扩张dCTP池

研究接下来验证了MPA和RBV能否通过抑制IMPDH来耗竭鸟嘌呤核苷三磷酸。用MPA和RBV处理SAMHD1充足的THP-1细胞长达72小时，并每日提取和定量dNTP。结果显示，两者均在整个实验过程中显著耗竭了dGTP水平，并同时观察到dCTP池的显著扩张，这种不平衡持续至少72小时。这支持了MPA和RBV在白血病细胞中抑制IMPDH，从而阻断鸟嘌呤核苷酸的生成，并导致嘌呤和嘧啶dNTP池失衡的结论。

⁵IMPDH抑制剂与阿糖胞苷的药物组合效应与血液癌细胞模型中SAMHD1丰度相关

研究进一步在未经过基因编辑的癌细胞模型中验证了这种关系。通过评估9个具有不同基础SAMHD1蛋白水平的血液癌细胞系，发现MPA或RBV与ara-C联用产生的药物组合评分与SAMHD1蛋白丰度呈强显著正相关。这种相关性从高表达SAMHD1的细胞模型中的协同组合效应，延伸到缺乏基础SAMHD1表达的细胞模型中的弱拮抗关系。这表明SAMHD1蛋白水平决定了ara-C与IMPDH抑制剂之间药物相互作用的程度。

⁶IMPDH抑制增强阿糖胞苷诱导的DNA损伤和细胞凋亡

研究探讨了IMPDH抑制剂是否能以SAMHD1依赖的方式增强ara-C诱导的DNA损伤和凋亡信号。在SAMHD1充足的THP-1细胞中，ara-C与MPA共处理增加了活性caspase产物切割的PARP（cleaved-PARP）和DNA损伤信号组蛋白变体γH2AX的丰度。而在缺乏SAMHD1的细胞中，单独使用ara-C已能引发强烈的γH2AX和cleaved-PARP信号，MPA的加入并未进一步增强此表型。利巴韦林也得出类似结果。通过膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（PI）染色结合流式细胞术检测凋亡细胞比例，进一步证实了这些发现。在SAMHD1充足细胞中，MPA单独处理导致凋亡细胞小幅增加，但与ara-C联用时能显著扩大凋亡群体。相反，在SAMHD1缺失细胞中，添加MPA会拮抗ara-C诱导的凋亡。这些结果表明IMPDH抑制剂能以SAMHD1依赖的方式调节ara-C诱导的DNA损伤和凋亡信号。

+/+ 或 SAMHD1^?/?THP-1细胞用MPA和递增浓度的ara-C培养24小时后进行免疫印迹分析。(C-F) SAMHD1^+/+或 SAMHD1^?/?THP-1细胞用ara-C和/或MPA培养48小时后，通过膜联蛋白V/PI染色和流式细胞术分析凋亡。">

⁷补充脱氧鸟苷可逆转IMPDH抑制剂与阿糖胞苷在表达SAMHD1的白血病细胞中的联合效应

为确证观察到的表型是由于dGTP生物合成减少所致，研究在培养基中补充了细胞可渗透的dGTP前体脱氧鸟苷（deoxyguanosine, dGuo），以期恢复细胞内dGTP水平。实验发现，增加dGuo浓度可恢复细胞活力，并以剂量依赖的方式降低IMPDH抑制剂与ara-C在SAMHD1充足细胞中的药物组合效应。在SAMHD1缺失细胞中，未观察到ara-C增敏的实质性变化。同时，补充dGuo也降低了ara-C与IMPDH抑制剂联合处理所引发的DNA损伤和凋亡信号级联反应。这些数据表明，ara-C与IMPDH抑制剂联用观察到的SAMHD1依赖性协同作用和DNA损伤/凋亡信号，是由于dGTP生物合成减少所致。

+/+ 和 SAMHD1^?/?THP-1细胞中，ara-C和MPA的增殖抑制分析。(B) 根据(A)中处理得出的ara-C和MPA药物协同图。(C) SAMHD1^+/+THP-1细胞用所示剂量ara-C和/或MPA，在有或无dGuo情况下培养24小时后，进行免疫印迹分析。">

⁸讨论与结论

该研究证实，已获批的药物MPA和利巴韦林——靶向鸟嘌呤核苷酸生产限速酶IMPDH——能够失衡白血病细胞中的dNTP池，从而间接抑制SAMHD1的ara-CTP水解活性。虽然IMPDH抑制剂耗竭dGTP并扩张dCTP池的确切分子机制，与之前报道的非变构RNR抑制剂（导致dCTP与dATP比例逆转）的机制是否完全相同尚需进一步阐明，但两者都指向通过扰动dNTP池、改变SAMHD1变构激活来间接影响其底物特异性这一共同路径。补充dGuo可逆转IMPDH抑制剂的效应，进一步将表型锚定在dGTP耗竭上。

IMPDH抑制剂本身具有单药抗白血病活性，将其用作间接靶向SAMHD1的方法，结合了各自具有活性的药物，是设计联合疗法的重要考量。虽然MPA和RBV并非化学探针，可能具有额外的细胞靶点，但使用两种化学结构不同的分子重现了研究结果，增强了结论的可靠性。未来的研究需在更复杂的临床前癌症模型中进行验证，并可能使用化学探针或遗传学方法更特异地扰动IMPDH功能。

总之，本研究提出了利用IMPDH抑制剂间接靶向SAMHD1的新策略，通过耗竭鸟苷酸、扰动dNTP池来克服SAMHD1介导的ara-C耐药性。重新利用IMPDH抑制剂，并将其与ara-C联合使用，在改善AML治疗方面具有潜在的临床应用价值。