《Food Science & Nutrition》：Profiling of the Endogenous Phenolic Contents of Multifloral Honey From Different Geographical Origins in Türkiye by LC-MS/MS
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蜂蜜作为古老的天然产物，其生物活性备受关注。本研究采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统分析土耳其七大地域99份多花蜂蜜中的25种内源性酚类物质，揭示其组成与地理、植物来源的显著相关性，为蜂蜜功能品质评价和产地追溯提供了新的化学指纹依据。
1 引言
天然来源的生物活性化合物近年来备受关注。蜂蜜作为最古老的传统甜味剂之一，约由200种不同物质构成，包括酶类、黄酮类、酚酸、挥发性化合物以及多种糖类（如葡萄糖、果糖、蔗糖），还含有约0.5%的蛋白质、约17.5%的水分以及维生素和矿物质（通常占0.04%~0.2%）。其主要成分为水、葡萄糖、果糖、蔗糖、矿物质和蛋白质。由于其成分受蜜蜂访花种类、地理来源及加工方法等多种因素影响，蜂蜜一直是科学家持续研究的主题。
酚类化合物是蜂蜜中一类关键的次生代谢产物，影响着其感官吸引力和健康特性。这些化合物包括黄酮类、酚酸和多酚，源自多种植物来源，并显著贡献于蜂蜜的抗氧化能力，对抗氧化应激。它们还表现出抗菌特性，有助于蜂蜜的保存和防止变质。此外，酚类化合物具有抗炎特性，增强了蜂蜜治疗炎症相关疾病的潜力。它们的含量与蜂蜜在对抗癌症、糖尿病和心血管疾病方面的健康益处相关。
然而，蜂蜜中酚类化合物的组成会因植物来源、季节和环境条件、地理起源及加工方法等因素而有显著差异。这种变异性导致了世界各地不同蜂蜜在化学组成、物理性质、口感特征和生物活性方面的独特性。酚类组成还可用于评估蜂蜜质量和真实性，区分单花蜜和多花蜜，并提供其产地信息。这凸显了酚类化合物在评估蜂蜜作为功能性食品和天然疗法时的重要性。
土耳其凭借其多样的植被和独特的地理环境，为研究蜂蜜酚类物质（由蜜蜂作用于花蜜产生的物质）提供了一个有趣的研究区域。多花蜂蜜产自多种植物来源，其复杂的基质蕴含着高度的酚类多样性。过去十年对土耳其蜂蜜酚类物质含量的研究主要集中在省级、区域性和单花蜜样本上。本研究旨在利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等先进分析技术，调查来自土耳其七个地区、34个省份的99份多花蜂蜜样品中的25种不同酚类化合物。目标是表征土耳其多花蜂蜜的酚类谱图，揭示其营养和药用价值，增进对其潜在健康影响的理解。这项研究可为蜂蜜行业的质量控制提供信息，确保土耳其多花蜂蜜产品的真实性和标准化。除了增进对土耳其蜂蜜酚类成分的理解外，本研究还可以支持蜂蜜在全球市场的价值。
2 材料与方法
2.1 样品收集
于2018年3月至8月期间，从土耳其七个不同地理区域的养蜂人处直接购买了总计99份多花蜂蜜样品。每份蜂蜜样品取50克，置于无菌聚乙烯管中运输至实验室，并在室温避光条件下储存直至分析。研究材料的99份蜂蜜样品地理来源见图1和表1。
2.2 蜂蜜提取流程
LC-MS/MS分析的提取方法参考了Durmaz的描述，最初由Altun和Aydemir提出。所有化学品均为分析纯，购自德国达姆施塔特的默克公司。为制备样品，将25克蜂蜜与酸性水（pH 2，使用HCl）按5:1的比例充分混合，并用棉布过滤以去除固体颗粒。所得滤液通过装有Amberlite XAD-4树脂的玻璃柱，该树脂选择性保留酚类化合物，同时用酸性水和纯水洗涤掉糖类和其他极性物质。洗涤后，用甲醇和减压浓缩酚类组分。剩余残留物溶于水，用乙醚分配，然后合并并用旋转蒸发器浓缩。由于许多研究都集中在使用Amberlite XAD-4树脂从蜂蜜中提取酚类化合物，且该方法除了需要大量蜂蜜和溶剂外还需使用乙醚，本研究因其选择性萃取能力而选择了乙醚。
2.3 通过LC–MS/MS分析酚类组成
对于LC-MS/MS分析，将浓缩的残留物溶解在甲醇中，并通过0.45 μm膜过滤，然后使用与串联质谱仪耦合的超高效液相色谱仪器分析酚类物质。本研究调查了多花蜂蜜中是否存在以下酚类化合物：儿茶素水合物、乙酰氧肟酸、香草酸、白藜芦醇、富马酸、没食子酸、咖啡酸、根皮苷二水合物、橄榄苦苷、羟肉桂酸、鞣花酸、杨梅素、原儿茶酸、水飞蓟素、2-羟基-1，4-萘醌、紫铆因、柚皮素、木犀草素、山奈酚、姜黄素、百里醌、茜素、羟基苯甲酸、水杨酸和槲皮素。LC–MS/MS系统包括与三重四极杆质谱仪耦合的UHPLC Shimadzu Nexera设备。该系统包含LC-20 AD梯度泵、DGU-20A3R脱气机、CTO-10ASvp柱温箱和SIL-20 AC自动进样器。使用C-18 Intersil ODS-4柱进行色谱分离。柱温为40°C，进样体积为2 μL。流动相由超纯水中含0.1%甲酸（溶剂A）和甲醇中含0.1%甲酸（溶剂B）组成。流动相流速设定为0.3 mL/min。色谱分离总运行时间为10分钟。流动相初始组成为95%溶剂A和5%溶剂B，在0至4分钟之间应用线性梯度达到95%溶剂B。然后系统在4至7分钟内等度保持95%溶剂B以洗脱极性较小的化合物并促进柱清洗。在7.01分钟时，流动相返回初始条件（95%溶剂A和5%溶剂B），并在剩余运行时间内保持这些条件以确保色谱柱为下一次进样完全重新平衡。
质谱分析使用带有电喷雾电离（ESI）接口的三重四极杆质谱仪进行。质谱仪在预定多反应监测（MRM）模式下运行。为确保在负离子和正离子电离模式下稳定的离子产生，ESI源和气体参数设置如下：雾化气流速：3.0 L/min（氮气），干燥气流速：15.0 L/min（氮气），加热气流速：10.0 L/min（空气），碰撞气（氩气）：230 kPa，脱溶剂线温度：250°C，加热块温度：400°C。
通过LC-MS/MS分析的酚类化合物的优化MRM转换、保留时间和验证参数见附表S1。
2.4 统计分析
使用IBM SPSS版本16.00软件进行统计分析。采用单向方差分析（ANOVA）比较各区域蜂蜜中酚类化合物的水平。方差分析后，进行Duncan多重范围检验以确定组间均值差异。结果以平均值±标准误表示。使用Minitab 16.2.1软件进行主成分分析（PCA）统计分析。在进行PCA之前，所有变量均标准化为零均值和单位方差。
3 结果与讨论
为化学防御而在天然产物中合成的酚类化合物与许多生物活性相关，如抗氧化、抗炎、抗糖尿病和抗癌特性。这引发了人们对蜂蜜酚类含量的好奇。本研究的主要目的是分析从土耳其获得的多花蜂蜜样品的酚类谱图。我们使用LC-MS/MS技术分析了土耳其七个不同地理区域生产的多花蜂蜜中的25种不同酚类化合物。酚类含量因地区而异，且地区之间存在统计学差异。
测量到的最高的酚类成分是来自中安纳托利亚地区和东安纳托利亚地区蜂蜜样品中的羟肉桂酸，含量分别为100.94 ± 12.79 μg/100 g和103.60 ± 17.76 μg/100 g。其次是马尔马拉地区、爱琴海地区和黑海地区，含量分别为119.32 ± 17.26 μg/100 g、147.88 ± 15.99 μg/100 g和204.83 ± 33.28 μg/100 g。而地中海地区和东南安纳托利亚地区蜂蜜样品中含量最高的是香草酸，含量分别为114.38 ± 41.52 μg/100 g和148.53 ± 81.72 μg/100 g。在土耳其蜂蜜中鉴定出的酚类化合物见表2、表3和附图S1。LC-MS/MS数据显示土耳其蜂蜜中存在20种不同的酚类化合物。东安纳托利亚蜂蜜样品的酚类化合物多样性最高，有20种不同类型。相比之下，爱琴海和黑海蜂蜜的多样性最低，只有16种酚类化合物。
4 结论
本研究发现蜂蜜中的酚类化合物含量存在显著的地理差异，这主要归因于各地的植物区系不同。研究成功鉴定了20种酚类物质，其中羟肉桂酸和香草酸是土耳其多地蜂蜜中最主要的酚类成分。值得注意的是，茜素、杨梅素、原儿茶酸、百里醌和2-羟基-1，4-萘醌在所有测试样本中均未检出。这些结果再次强调了地理差异和蜂蜜来源植物区系对其酚类含量的影响。研究提供了关于在植物和蜂蜜种类繁多的土耳其不同地区生产的蜂蜜酚类含量的宝贵信息。该研究不仅增进了对土耳其蜂蜜酚类成分的理解，其建立的化学谱图还有助于蜂蜜的质量控制、真实性鉴别和地理溯源，支持了蜂蜜作为功能性食品和天然疗法的价值，对全球蜂蜜市场具有积极意义。
