《Food Science & Nutrition》：γ-Glutamylcysteine Alleviates t-BHP-Induced Oxidative Damage in NIH/3T3 Fibroblasts by Promoting Nuclear Translocation of Nrf2
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本文研究揭示，γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GC）作为谷胱甘肽（GSH）的直接前体，在体外模型中有效保护成纤维细胞免受氧化应激损伤。其核心机制在于，γ-GC不仅能直接清除活性氧（ROS），还能通过上调核因子E2相关因子2（Nrf2）蛋白水平并促进其核转位，重塑细胞内抗氧化防御系统，维持线粒体功能稳态，从而抑制线粒体凋亡通路。该研究明确了γ-GC通过激活Nrf2/KEAP1信号轴发挥保护作用的分子途径，为改善氧化应激导致的组织修复异常提供了新的潜在治疗策略。
引言
成纤维细胞广泛存在于多种组织中，不仅通过细胞外基质（ECM）的沉积和重塑支持组织结构，还通过分泌和响应细胞因子、趋化因子及生长因子，主动参与协调多种生物过程。在各种形式的组织损伤中，成纤维细胞在恢复组织完整性的复杂过程中扮演着关键角色。然而，氧化应激导致的成纤维细胞功能受损是阻碍组织修复的常见因素。活性氧（ROS）的过量产生会导致成纤维细胞增殖和迁移异常、诱导细胞凋亡，并破坏ECM沉积与转化，从而阻碍组织修复进程。因此，降低细胞内ROS水平是增强成纤维细胞功能、促进组织修复的关键策略。
γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GC）是内源性谷胱甘肽（GSH）合成途径的中间体，具有多种生物学效应。本研究旨在探讨γ-GC对ROS诱导的成纤维细胞损伤的保护作用及其潜在机制。
γ-GC减轻t-BHP诱导的NIH/3T3成纤维细胞凋亡
研究采用叔丁基过氧化氢（t-BHP）处理NIH/3T3成纤维细胞建立体外氧化应激损伤模型。细胞活力检测（CCK-8法）显示，t-BHP处理后细胞活力显著下降，而γ-GC能有效缓解这种下降，且呈剂量依赖性。蛋白质印迹（Western blot）分析表明，40和80 μM的γ-GC降低了切割型caspase-3（C-cas 3）与酶原型caspase-3（Pro-cas 3）的比值，提示γ-GC抑制了t-BHP诱导的caspase-3激活。进一步的流式细胞术分析（Annexin V-FITC/PI双染）证实，t-BHP刺激后Annexin V-FITC阳性细胞显著增加，而80 μM γ-GC处理可显著减少此类细胞。这些结果综合表明，γ-GC能保护NIH/3T3成纤维细胞免受t-BHP诱导的细胞凋亡。
γ-GC减轻t-BHP诱导的NIH/3T3成纤维细胞氧化应激
作为GSH的前体，γ-GC能迅速提升细胞内GSH水平。检测发现，γ-GC有效恢复了t-BHP处理后的GSH/氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值。同时，t-BHP暴露导致超氧化物歧化酶1（SOD1）和过氧化氢酶（CAT）的蛋白水平下降，而γ-GC（40， 80 μM）能以浓度依赖的方式逆转这一趋势。使用荧光探针DCFH-DA评估ROS水平的结果显示，t-BHP暴露后NIH/3T3细胞内的ROS水平升高，而γ-GC处理能显著降低此水平。流式细胞术对细胞内ROS的定量分析也得出一致结论。这些发现表明，γ-GC通过增强细胞内抗氧化防御机制，减轻了t-BHP诱导的氧化应激。
γ-GC缓解氧化应激诱导的NIH/3T3成纤维细胞线粒体膜电位崩溃和功能障碍
线粒体是ROS损伤的主要靶点，表现为线粒体膜电位（MMP）丧失和形态改变。使用JC-1探针评估MMP发现，t-BHP暴露后绿色荧光显著增强，表明线粒体膜去极化。而γ-GC预处理减轻了t-BHP引起的MMP变化，表现为绿色荧光减弱和红色荧光恢复。流式细胞术分析也证实了这一结果。
透射电子显微镜（TEM）分析显示，t-BHP处理后线粒体体积增大、密度降低、内部嵴结构破坏甚至消失、边界模糊。而γ-GC处理后，线粒体密度增加，嵴的连续性得到恢复。MMP的崩溃导致细胞色素C（cyto-C）释放到细胞质中，并触发一系列级联放大反应，最终激活caspase 3并导致细胞凋亡。蛋白质印迹分析评估了线粒体凋亡途径相关蛋白水平，结果显示t-BHP刺激导致cyto-C蛋白水平显著升高，并改变了Bax/Bcl-2的比值。然而，γ-GC预处理显著抑制了cyto-C的蛋白水平和Bax/Bcl-2比值。这些发现表明，γ-GC预处理减轻了氧化应激诱导的MMP降低和线粒体功能障碍，从而调控了凋亡过程。
γ-GC促进NIH/3T3成纤维细胞中Nrf2的核转位
核因子E2相关因子2（Nrf2）的蛋白水平和亚细胞定位在介导抗氧化反应中至关重要。研究发现，40和80 μM的γ-GC能显著提高总Nrf2蛋白水平，并降低Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）的水平，这表明γ-GC可能通过Nrf2信号通路发挥其生物学效应。对Nrf2亚细胞分布的进一步研究显示，γ-GC（20， 40， 80 μM）显著增加了Nrf2的核定位，同时降低了其胞质水平。这些结果表明，γ-GC促进了NIH/3T3成纤维细胞中Nrf2的核转位。
γ-GC通过促进Nrf2核转位保护NIH/3T3成纤维细胞免受ROS诱导的损伤
为进一步验证γ-GC是否通过促进Nrf2核转位来发挥生物学效应，研究使用了Nrf2特异性抑制剂ML385。结果表明，与γ-GC处理组相比，ML385处理降低了总Nrf2和核内Nrf2的蛋白水平，同时增加了胞质Nrf2的蛋白水平，说明ML385有效抑制了γ-GC对Nrf2核转位的促进作用。随后通过蛋白质印迹检测下游蛋白水平发现，抑制Nrf2核转位抵消了γ-GC对SOD1和CAT蛋白水平的促进作用。
此外，这种抑制还导致与线粒体途径相关的凋亡蛋白水平上调，包括cyto-C、Bax/Bcl-2比值以及C-cas 3/Pro-cas 3比值。这些发现表明，γ-GC通过促进Nrf2核转位，有助于保护NIH/3T3成纤维细胞免受ROS诱导的细胞损伤。
讨论
成纤维细胞是组织修复的关键效应细胞，其功能受损会破坏组织修复过程。ROS诱导的损伤是成纤维细胞最常见的损伤类型之一。抗氧化防御系统是细胞内抵抗ROS的重要机制，在维持细胞氧化还原稳态和细胞功能完整性方面起着至关重要的作用。然而，过量的ROS会耗尽抗氧化防御系统，导致ROS诱导的细胞损伤。此外，线粒体既是ROS损伤的主要靶点，也是其主要来源。ROS对线粒体的损伤导致更多ROS释放，形成一个加剧细胞氧化损伤的有害反馈循环。因此，重塑抗氧化防御系统和恢复正常的线粒体功能对于减轻ROS造成的损伤至关重要。
大量研究表明，γ-GC作为GSH的前体，能被转运到细胞中，并在谷胱甘肽合成酶（GSS）的催化下迅速增加细胞内GSH水平，在增强细胞抗氧化能力方面显示出显著功效。本研究在成纤维细胞中观察到，γ-GC可以降低C-cas-3与Pro-cas3的比值，下调Bax/Bcl-2比值，并减少Annexin V-FITC阳性细胞的数量。与此同时，本研究进一步揭示，在成纤维细胞中，这种抗凋亡作用依赖于由Nrf2核转位介导的抗氧化通路的激活。
更重要的是，γ-GC可以不依赖于其向谷胱甘肽的转化而独立发挥抗氧化作用。本研究利用t-BHP诱导的NIH/3T3成纤维细胞作为ROS损伤模型，在体外探讨了γ-GC的抗氧化机制。结果表明，γ-GC处理增加了细胞内抗氧化剂（包括GSH、CAT和SOD1）的水平，从而重组了抗氧化防御系统。值得注意的是，研究观察到在γ-GC浓度为20 μM时，GSH/GSSG比值有所增加，但CAT和SOD1水平没有相应增加，也没有后续的抗凋亡效应。这些发现提示γ-GC的抗氧化功效可能是浓度依赖性的。此外，研究发现γ-GC可以通过恢复t-BHP损伤的成纤维细胞的MMP和修复线粒体嵴结构的完整性来抑制细胞凋亡。
Nrf2作为一种调节细胞氧化应激的转录因子，能够启动抗氧化相关基因的转录。其经典调控涉及与KEAP1的相互作用。在静息状态下，Nrf2与KEAP1结合，后者将其锚定在细胞质中，并通过促进泛素化和随后的降解来抑制其活性。当与KEAP1解离后，Nrf2转位到细胞核，与靶基因的抗氧化反应元件（ARE）或亲电反应元件（EpRE）结合，从而激活下游基因（如GSH、CAT和SOD）的表达。不同于在神经细胞中的发现，本研究在成纤维细胞中观察到，γ-GC不仅上调了Nrf2的总蛋白水平，还通过下调KEAP1的表达显著促进了Nrf2的核转位。这一过程是γ-GC增强成纤维细胞中抗氧化酶（SOD1、CAT）表达并抑制线粒体凋亡途径的关键前提。
在探究γ-GC的抗氧化机制时，观察到该化合物不仅能提高Nrf2的总蛋白水平，还能促进其核转位，从而启动下游抗氧化活性相关基因的转录。值得注意的是，在γ-GC浓度为20 μM时，总Nrf2蛋白水平没有显著增加，但观察到核内Nrf2蛋白水平增加，同时胞质Nrf2水平降低。这表明γ-GC在增强Nrf2核转位方面起着至关重要的作用。
结论
γ-GC降低了t-BHP诱导的NIH/3T3成纤维细胞中的ROS水平，恢复了抗氧化防御系统，重建了正常的线粒体功能，并抑制了ROS诱导的线粒体凋亡途径。此外，γ-GC通过促进Nrf2核转位，对成纤维细胞免受ROS诱导的损伤产生了保护作用。
