《Scientific Reports》：ABE9 fused to SpRY Cas9 nickase enables precise generation of bystander free mouse models
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本研究为应对传统方法在模拟点突变遗传病时面临的技术挑战，研究人员开展了主题为“ABE9-SpRY：一种用于精确构建点突变模型的PAM灵活型腺嘌呤碱基编辑器”的研究。结果表明，将ABE9与PAM灵活的SpRY-Cas9缺口酶融合，可在小鼠胚胎中高效（最高达96%）实现靶向A-to-G编辑，并显著减少脱靶效应与旁位编辑。其意义在于提供了一种高精度、高纯度的基因编辑工具，为疾病模型构建及疗法开发奠定了技术基础。
在探索生命奥秘的道路上，科学家们一直在与基因中的微小错误——点突变（Point mutations）作斗争。这些细微的、通常只是一个字母（核苷酸）的改变，却是许多遗传性疾病的根源。为了揭示这些突变如何导致疾病，并探索可能的治疗方法，研究人员需要能在实验动物（尤其是小鼠）身上精确再现这些突变的模型。然而，传统的方法如同拿着一把“分子剪刀”Cas9进行切割，虽然强大，但过程容易出错，会产生不必要的DNA双链断裂（DSBs， Double-Strand Breaks），引入不可控的插入或缺失，并且常常需要额外提供修复模板，整个过程繁琐且最终产物的纯度不尽如人意。更重要的是，许多致病突变是单核苷酸变异（SNVs， Single-Nucleotide Variants），传统方法对此“束手无策”或效率低下。腺嘌呤碱基编辑器（ABEs， Adenine Base Editors）的出现带来了曙光，它能够在不切断DNA双链的情况下，直接将A（腺嘌呤）精准地转换为G（鸟嘌呤），实现了“A-to-G”的编辑。但早期的ABE技术仍有其局限：它们可编辑的基因位点范围受PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列限制，就像一把钥匙只能开特定的锁；编辑时可能“误伤”目标位点附近的正常碱基，产生不想要的“旁位编辑”（bystander editing）；还存在潜在的“脱靶效应”（off-target effects），即在非目标基因位点进行错误修改。这些缺陷限制了ABE在构建高保真疾病模型中的应用。为了攻克这些难题，一项发表在《Scientific Reports》上的研究应运而生，旨在开发一种更精准、更灵活、更可靠的基因编辑工具。
为开展此项研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：首先，运用了蛋白质工程策略，将新一代腺嘌呤碱基编辑器ABE9与一种具有PAM序列灵活性的SpRY-Cas9缺口酶（nickase）进行融合，构建了新型编辑器ABE9-SpRY。其次，利用小鼠胚胎显微注射技术，将编辑系统（包括ABE9-SpRY mRNA及特定设计的单向导RNA， sgRNA）直接导入受精卵，以在体内评估其编辑效率与特异性。再次，为评估脱靶风险，研究采用了基于计算机预测的潜在脱靶位点分析，并结合了正交的R-环（R-loop）检测方法进行验证。最后，研究还在人类诱导多能干细胞（hiPSCs， human induced pluripotent stem cells）中对编辑器的性能进行了概念验证。
结果
ABE9-SpRY在小鼠胚胎中高效实现靶向A-to-G编辑
研究人员设计了针对四个不同基因位点的sgRNA，并将ABE9-SpRY系统注射到小鼠胚胎中。测序分析显示，ABE9-SpRY成功在四个靶点中的三个实现了高效的A-to-G编辑，证明了其体内编辑的有效性。在成功编辑的位点中，编辑效率在个体成年奠基小鼠（founder mice）中可高达96%。
ABE9-SpRY相较于ABE8e-SpRY具有更低的脱靶效应
为评估新编辑器的精确性，研究比较了ABE9-SpRY与其前代版本ABE8e-SpRY的脱靶情况。通过对小鼠胚胎编辑后样本进行深度测序，以及对预测的DNA脱靶位点进行分析，发现ABE9-SpRY在这些位点引起的脱靶编辑事件更少。此外，一种不依赖于sgRNA序列的正交R-环检测结果也证实，ABE9-SpRY产生的脱靶RNA编辑水平低于ABE8e-SpRY。
ABE9-SpRY在小鼠胚胎和hiPSCs中展现更高的产物纯度
“旁位编辑”是碱基编辑中一个关键问题，即在目标A碱基附近的其他A也被非特异性编辑。研究通过在小鼠胚胎中混合注射针对同一靶点的不同sgRNA池，评估了编辑产物的纯度。结果表明，在相同条件下，ABE9-SpRY产生的“仅目标位点编辑、无旁位编辑”的纯净产物比例显著高于ABE8e-SpRY。作为概念验证，在人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的一个内源性基因位点进行的编辑实验也得到了一致结论：ABE9-SpRY能产生纯度更高的编辑产物。
讨论与结论
本研究成功开发并验证了一种新型腺嘌呤碱基编辑器ABE9-SpRY。该编辑器通过融合ABE9与PAM序列灵活的SpRY-Cas9缺口酶，实现了两大核心优势：一是极大地扩展了可编辑的基因组范围，几乎不再受传统PAM序列的限制，增加了工具的通用性；二是显著提升了编辑的精确度与产物的纯净度。实验数据表明，ABE9-SpRY能够在活体小鼠胚胎中高效、特异地引入目标点突变，其编辑效率可满足构建疾病模型的需求。同时，与上一代工具相比，它在DNA和RNA水平均表现出更低的脱靶倾向，并且在编辑时能更有效地避免不想要的旁位编辑，从而产生更高纯度的基因修饰细胞或动物。
尽管编辑性能在一定程度上仍受靶点序列背景的影响，但本研究提供的数据强有力地支持ABE9-SpRY作为一种高精度、PAM灵活的基因编辑工具。其重要意义在于，为研究人员提供了一种强大的新手段，用于构建能够精确模拟人类点突变遗传病、且背景“干净”（无旁位编辑干扰）的小鼠及其他生物模型。这类高保真模型的建立，对于在分子和生理水平上准确理解基因突变与疾病表型之间的因果关系至关重要，并将最终加速针对遗传性疾病的靶向治疗策略的研发进程。
