《Scientific Reports》：Effects of repeated freeze and thaw cycles on the stability of faecal microbiome composition
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本研究旨在解决既往收集的粪便样本在经历多次冻融循环后，其微生物组组成的稳定性问题。研究人员系统分析了多次冻融对16S rRNA基因测序及微生物组组成的影响。结果显示，个体间差异始终大于冻融效应的影响，首次冻融后仅有少数菌属丰度发生显著改变，后续循环影响有限。该发现支持经历了单次解冻的已储存粪便样本的可重复利用性，为资源高效利用的研究提供了依据。
在生命科学领域，尤其是涉及人体微生物组的研究中，科学家们常常依赖于从志愿者那里收集的生物样本。随着大型队列研究的开展和研究问题的不断深入，一个现实而普遍的需求出现了：能否对已经收集并储存在超低温冰箱中的宝贵样本进行“二次开发”，用它们来回答新的科学问题？这听起来是个既节约时间又节约资源的好主意。然而，一个潜在的“隐忧”也随之浮出水面：这些样本在储存和运输过程中，难免会经历温度波动，甚至是被取出、使用一部分后再放回冰箱的“冻融”过程。这种反复的冻结与解冻，就像是对样本内部微观世界的一次次“气候剧变”，会不会彻底改变其中微生物（即粪便微生物组）的“人口普查”结果呢？如果答案是肯定的，那么基于这些“失真”数据的分析结论将变得不可靠。因此，迫切需要对反复冻融循环是否会影响粪便微生物组组成的稳定性进行系统评估，这直接关系到已存储样本能否被安全、有效地重复利用，是提升科研资源利用效率的关键一环。
为了回答这一核心问题，一组研究人员开展了一项针对性研究，相关成果已发表在《Scientific Reports》期刊上。他们的核心目标是探究反复的冻融循环对基于16S核糖体RNA（16S rRNA）基因测序技术来准确、一致地测量肠道微生物组组成的能力会产生何种影响。
本研究主要运用了以下关键技术方法：研究基于16S rRNA基因测序技术对样本的微生物组组成进行解析；在数据分析阶段，采用了两种差异丰度分析方法进行比对，一种是MaAsLin2（Multivariate Association with Linear Models 2，线性模型的多变量关联分析2），另一种是更为保守的ALDEx2（Analysis of Differential Abundance taking sample variation into account，考虑样本变异的差异丰度分析）；研究通过对同一批粪便样本施加从一次到最多六次不等的冻融循环处理，系统比较了处理前后微生物组特征的变化。
反复冻融后微生物组组成的变化
研究人员首先从整体上评估了冻融循环对微生物组组成的影响。分析表明，不同个体样本之间的差异（即个体间差异）始终远超于由任何次数的冻融循环所引入的影响。这意味着，在研究中，个体独特的微生物组特征信号很强，冻融处理带来的噪音相对较弱，不太可能掩盖真实的生物学差异。
差异丰度分析揭示有限变化
接下来，他们使用差异丰度分析方法来识别在冻融循环后丰度发生显著变化的特定微生物类群（属级别）。当使用MaAsLin2方法将经历了一次冻融循环的样本与新鲜未冷冻的样本进行比较时，仅发现了数量有限的微生物属发生了显著改变。更为重要的是，当比较第二次、第三次冻融循环与第一次冻融循环后的样本时，并未检测到任何显著的进一步变化。然而，在后续更进一步的冻融循环（第四次至第六次）中，虽然整体影响不大，但研究者观察到某些特定分类群出现了轻微但渐进式的丰度偏移。作为对比，当采用更为保守的统计方法ALDEx2进行分析时，结果显示在任何冻融循环次数下，均未检测到微生物丰度存在显著变化。这一对比提示，所观察到的部分变化可能对分析方法较为敏感，且其效应幅度有限。
研究结论与重要意义
综上所述，本研究系统地评估了反复冻融循环对粪便微生物组稳定性的影响。核心结论是：个体间的微生物组差异是主导因素，远超过冻融处理本身可能引入的变异。尽管使用某些分析方法可以在极端多次冻融后检测到特定菌群的微小渐进式变化，但整体而言，尤其是经历单次解冻后，粪便微生物组的组成保持了高度的稳定性。这一发现具有重要的实际意义：它从数据层面提供了有力支持，表明重新利用那些已经历过单次解冻的储存粪便样本，用于新的微生物组学研究，其风险是极低的，不太会损害微生物组数据的完整性。这极大地鼓舞了科研人员对现有珍贵生物样本库进行深度挖掘和二次分析的信心，为在资源有限的情况下高效推进微生物组学及相关健康医学研究开辟了道路，避免了不必要的样本重复采集，符合科学研究的节约与增效原则。
