《MedComm》：Frequency- and Layer-Specific Modulation of Cortical Neuronal Activity by Pulsed Electrical Stimulation
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本研究揭示了60赫兹（LF）与160赫兹（HF）脉冲电刺激对小鼠初级体感皮层（S1）兴奋性与抑制性神经元活动的频率及层级特异性调控。高频（HF）刺激在刺激期间显著增强第2/3层兴奋性神经元钙（Ca2+）活性，而低频（LF）刺激的效果主要表现为刺激后增强。研究首次阐明电刺激主要通过调节神经元放电节律（而非单纯改变活动强度）发挥作用，为靶向神经元节律异常的神经精神疾病（如帕金森病、慢性疼痛）治疗提供了新的细胞水平解释。
引言
侵入性与非侵入性脑刺激技术，如深部脑刺激（DBS）、皮层刺激和经颅电刺激（TES），已被广泛应用于神经科学研究和临床治疗，以调节目标脑区的神经活动。刺激频率是决定其疗效的关键参数，例如，高频DBS（如130赫兹或160赫兹）常用于治疗帕金森病震颤，而低频DBS（如60赫兹）则能改善运动障碍等症状。然而，不同频率的电脉冲在细胞水平如何调控神经元活动的机制仍不明确。本研究旨在利用双光子钙成像技术，探究60赫兹（低频，LF）和160赫兹（高频，HF）脉冲电刺激对小鼠初级体感皮层（S1）兴奋性与抑制性神经元的特异性影响。
2.1 高频刺激在刺激期间增强第2/3层兴奋性神经元活动
通过向S1区显微注射AAV-CaMKIIα-GCaMP6s和AAV-GAD67-GCaMP6s病毒，并利用在体双光子钙成像技术，研究人员记录了刺激前、中、后第2/3层与第5层兴奋性神经元以及第2/3层抑制性神经元的钙活动。实验设计包括将刺激电极植入成像平面50微米范围内，并进行为期6分钟（2分钟基线、2分钟刺激、2分钟刺激后）的60赫兹或160赫兹电刺激记录。
结果显示，高频刺激在刺激期间使第2/3层兴奋性神经元的平均钙活性呈上升趋势，并显著增加了其放电频率和峰值幅度。相比之下，低频刺激仅增加了峰值幅度，对平均钙活性和放电频率无显著影响。通过将神经元分为“上调神经元”（活动增加≥10%）、“下调神经元”（活动减少≥10%）和“无变化神经元”，研究发现高频和低频刺激上调的神经元数量相似，且多数为同一群神经元。然而，高频刺激在这群共有的上调神经元中引发了更强的活动增强。同时，高频刺激在共有的下调神经元中引起的活动抑制更弱。综上，低频刺激分别上调和下调了不同神经元群体的活动，导致刺激期间总体活动无净变化；而高频刺激则在很大程度上重叠的神经元群体中产生了更强的活动上调与更弱的下调，最终导致刺激期间总体活动升高。
2.2 高频与低频刺激均在刺激停止后增强第2/3层兴奋性神经元活动
研究人员进一步分析了刺激停止后（刺激后vs.基线）神经元的活动。结果显示，无论是低频还是高频刺激停止后，第2/3层兴奋性神经元的平均钙活性和放电频率均较基线水平显著升高，且刺激后低频组的活性甚至高于刺激后高频组，但峰值幅度无变化。
神经元响应模式分析表明，两种频率刺激上调的神经元数量相似且高度重叠。这些共有的和单独的上调神经元在刺激后低频条件下表现出比刺激后高频条件下更高的钙活性，表明低频刺激在增强神经元活动方面具有延迟效应。总之，对于S1第2/3层兴奋性神经元，低频和高频刺激在停止后均能持续增强其钙活性，且低频在此阶段作用更强。高频刺激在刺激期间和之后均能强劲增加神经元活动，而低频刺激主要在刺激后增强活动，且在刺激期间增强了约50%神经元的活动（尽管总体活动无净上升）。
2.3 高频与低频刺激在刺激期间未提升第5层兴奋性神经元活动
对第5层锥体神经元在刺激期间的分析显示，高频刺激未改变其总体钙活性，但增加了放电频率；而低频刺激则显著降低了总体钙活性和放电频率，对峰值幅度无影响。
神经元响应模式分析显示，高频诱导的活动变化以上调神经元为主，而低频以下调神经元为主。共有的和单独的上调神经元在高频和低频刺激下活动增加程度相当，而共有的和单独的下调神经元在低频刺激下受到更强烈的抑制。总之，在刺激期间，高频刺激未引起第5层兴奋性神经元总体活动的净增加，而低频刺激引起了轻微的总体抑制。结合第2/3层神经元在刺激期间对高频有净增加、对低频无变化的结果，表明第5层锥体神经元相比浅层神经元对兴奋具有更强的抵抗性。
2.4 高频刺激在刺激停止后增强第5层兴奋性神经元活动
在刺激停止后，高频刺激引起了第5层锥体神经元总体活动的延迟性增加，放电频率显著升高；而低频刺激后的活动水平与基线相当。
响应模式上，高频刺激后以上调神经元为主，低频刺激后则以下调神经元为主。共有的下调神经元在高频和低频刺激下活动减少程度相似，但单独的下调神经元在低频刺激下受到更强的抑制。这表明高频刺激在提升兴奋性神经元活动方面更有效，而低频刺激在抑制兴奋性神经元活动方面效果更强。总之，对于第5层锥体神经元，与刺激期间相比，高频和低频刺激在停止后均继续增加总体钙活性。相较于基线，高频诱导了活动的净增加，而低频使活动水平保持相对稳定。
2.5 高频与低频刺激在刺激期间增强抑制性神经元活动
对S1皮层第2/3层抑制性神经元钙活动的分析表明，无论是低频还是高频刺激，均显著增加了抑制性神经元的钙活性和放电频率。低频刺激还增强了放电幅值。
两种频率刺激上调的神经元数量相似且高度重叠。上调神经元在两种刺激下活动增加程度相似，但共有的上调神经元在高频刺激下激活程度略高。下调神经元则在两种刺激下表现出相似的抑制。被激活的神经元数量远超被抑制的神经元，表明电刺激主要增强而非抑制抑制性神经元的活动。总之，低频和高频均能增强抑制性神经元的钙活性，且响应的神经元群体高度重叠，表明抑制性神经元对频率不敏感，两种刺激产生相似的效果。
2.6 低频与高频对神经元活动同步性产生持续影响
通过分析基于放电同步性的神经元活动相关系数，研究人员探究了刺激对神经元同步性的影响。对于第2/3层兴奋性神经元，其相关系数在低频刺激期间和之后均下降，而高频刺激期间不变，仅在停止后下降，表明神经元同步化程度仅在低频刺激期间和之后、以及高频刺激停止后降低。
对于第5层兴奋性神经元，其相关系数在高频刺激期间和之后均增加，而低频刺激期间不变，仅在停止后增加。对于第2/3层抑制性神经元，低频和高频刺激均导致其相关系数相似地增加，表明同步化程度提高。总之，电刺激对神经元活动同步性的影响具有持续性和后效应，且在不同层级和细胞类型中表现各异：它降低了第2/3层兴奋性神经元的同步性，但增强了第5层兴奋性神经元和第2/3层抑制性神经元的同步性。
讨论
本研究发现，无论是60赫兹（低频）还是160赫兹（高频）电刺激，对S1皮层兴奋性和抑制性神经元的调节作用都是通过调节钙放电频率来增强其钙活性。这与先前使用功能磁共振成像（fMRI）记录血氧水平依赖（BOLD）反应的研究结果一致。在静息状态下，神经元有其自发的活动节律。低频和高频主要通过改变放电频率来增强神经元活动。尽管观察到刺激对第2/3层神经元放电幅度有影响，但该效应在刺激停止后不持续，表明这是电流的直接瞬时效应，而放电频率的改变才是脉冲电刺激的主要作用。
第2/3层的兴奋性神经元比第5层的兴奋性神经元更容易被脉冲电刺激增加钙活性。这可能是因为第2/3层兴奋性神经元在生理状态下自发放电较低，而对电刺激更敏感。第5层兴奋性神经元通常具有更高的基础放电率，因此对额外的脉冲电刺激反应较弱。此外，电刺激激活一定范围内的轴突，并通过释放神经递质调节下游脑区活动。其效果似乎取决于汇聚到目标神经元的兴奋性和抑制性输入的相对分布。本研究中，S1皮层第2/3层的兴奋性和抑制性神经元主要接收兴奋性输入，这支持了它们在电刺激期间活动增强的现象。高频刺激在刺激期间就增强了第2/3层兴奋性神经元的钙活性，而低频刺激的效果在刺激停止后才开始显现，这可能是因为在相同脉宽下，高频刺激积累了更多的电荷，从而对神经元活动产生了更显著的影响。
电刺激诱导了不同层级和细胞类型神经元同步性的不同变化。同步性在第5层兴奋性神经元和第2/3层抑制性神经元中增强，这两类神经元在刺激前均表现出相对较高的自发放电频率。相反，在刺激前自发放电较低的第2/3层兴奋性神经元中，同步性减弱。这些数据表明，刺激对同步性的影响可能更多地取决于细胞的内在放电特性，而非位置或宽泛的细胞类型。
这些频率和层级特异性的同步性改变，也可能为电刺激的临床效果提供了机制联系。在帕金森病中，丘脑底核的高频DBS缓解了运动症状，而低频DBS改善了吞咽功能和步态冻结。尽管本研究的刺激施加于S1，但频率能以层级特异性方式系统性重塑同步性的原理可能具有广泛相关性。病理性β波段同步是帕金森病电路功能障碍的一个标志。在本实验中，高频刺激增强了第5层兴奋性神经元的同步性，而第5层是主要的皮层输出层。因此，高频DBS可能部分通过施加受调节的同步节律来抑制病理性的网络动力学。相反，低频刺激对第2/3层兴奋性神经元的显著去同步化，可能与偶尔在非治疗性低频刺激中看到的认知或感知副作用有关。
本研究结果也可能揭示电刺激治疗慢性疼痛的潜在机制。在疼痛状态下，初级感觉神经元的同步活动可引发S1皮层的同步性，疼痛本身会在该区域诱导稳定、过度活跃的微电路。先前研究表明，疼痛状况增加了S1第2/3层兴奋性神经元之间的同步性，人为增强S1同步性可降低痛阈。在此背景下，本研究发现脉冲电刺激能强力降低第2/3层兴奋性神经元的同步性，同时增强局部抑制性网络的同步性，这提示了一种潜在的治疗机制。通过靶向破坏与疼痛相关的过度同步，并可能重新平衡局部兴奋-抑制动态，电刺激可能有助于使病理性电路活动正常化。
除了神经元，S1中的胶质细胞也可能参与脉冲电刺激的调节。星形胶质细胞在神经元通讯中扮演主动角色，星形胶质细胞网络可以调节神经元活动。星形胶质细胞在电刺激下表现出钙水平的快速升高。激活的星形胶质细胞可能通过分泌腺苷和谷氨酸影响神经元活动。电刺激期间胶质细胞与神经细胞之间的相互作用仍有待阐明。
结论
本研究揭示了电刺激的频率特异性和层级特异性调制效应，为了解电刺激的细胞机制及其对神经精神疾病的潜在治疗应用提供了新的见解。
