《Materials Today Bio》：3D Printing- and Cyclic Strain-Driven Engineering of Skeletal Muscle Blocks Using Enhanced Viscoelastic Extracellular Matrix Bioink
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本文针对传统细胞外基质（ECM）生物墨水力学性能不足、难以支撑功能性骨骼肌构建的难题，报道了一种结合异丙醇（IPA）增强脱脂处理的肌肉源性细胞外基质（MdECM）生物墨水，并整合三维打印辅助的柱状约束框架与可拉伸多腔室生物反应器，成功实现了肌管定向排列、力学成熟及收缩功能的提升，为肌肉再生治疗与药物筛选提供了可扩展的平台。
想象一下，如果因创伤、疾病或衰老导致肌肉严重损失，我们能否像更换零件一样，在实验室里“制造”出功能完好的肌肉组织进行移植？或者，在开发治疗肌肉萎缩（如肌少症）的新药时，能否有一种更逼真、高效的体外模型来测试药效，避免直接进行昂贵且耗时的动物实验？这正是骨骼肌组织工程致力于解决的重大挑战。然而，构建在结构（肌纤维有序排列）和功能（能够收缩）上都接近天然肌肉的人工组织并非易事。其中，用于承载细胞的“土壤”——生物墨水，其机械性能尤为关键。传统来源于肌肉的脱细胞细胞外基质（dECM）生物墨水虽然提供了良好的生化微环境，但其力学强度、形状保持能力和黏弹性往往不足，难以在培养过程中有效传递细胞产生的力，从而无法引导肌细胞融合成排列整齐、能够收缩的肌管。此外，如何在一个可控、可重复且规模化的系统中，为这些工程化肌肉块施加类似人体运动时的机械拉伸刺激，以促进其成熟，也是领域内的一个技术瓶颈。
针对上述问题，由Jae Woo Back、Da-Young Jo、Jeong-Ho Lee、Jae-Seong Lee、Minjun Ahn和Byoung Soo Kim组成的研究团队在《Materials Today Bio》上发表了一项创新性研究。他们开发了一种整合性策略，核心是一种经过改良的、具有增强黏弹性的肌肉源性细胞外基质（MdECM）生物墨水，并将其与一套三维（3D）打印辅助的循环应变生物反应器系统相结合。研究旨在解决生物墨水力学性能不足和工程肌肉功能成熟困难的问题，最终成功构建出具有高度排列性、分子表达成熟且具备收缩功能的骨骼肌微组织块，为再生医学和药物筛选提供了新工具。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：1. 改进的脱细胞化与生物墨制备：从猪胫骨前肌获取组织，采用包含异丙醇（IPA）处理的步骤进行脱细胞化，以有效去除残留脂质，制备成肌肉源性细胞外基质（MdECM）生物墨水，并对其流变学性能（黏弹性、触变恢复、凝胶动力学等）进行全面表征。2. 三维打印与细胞封装培养：利用3D打印技术制造具有不同直径和间距的聚己内酯（PCL）柱状框架，将小鼠C2C12成肌细胞封装于优化的MdECM生物墨水中，注入框架内进行培养和分化。3. 可拉伸多腔室生物反应器的设计与应用：使用Ecoflex?弹性材料通过模具浇铸制造多腔室平台，结合线性驱动器和Arduino控制系统，构建能够对多个肌肉块同步施加可控循环单轴应变（如10%或20%）的生物反应器系统，并利用有限元分析（FEA）优化平台应变均匀性。4. 多层次的分析与表征：通过组织学染色、免疫荧光、定量聚合酶链式反应（qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）评估脱细胞效果、细胞活性、肌管排列及肌源性标志物表达；通过钙成像和电刺激验证构建体的收缩功能；并进行单轴拉伸测试以评估构建体的机械性能。
研究结果部分揭示了以下关键发现：
3.1. 骨骼肌特异性生物墨水的优化与表征
研究人员对猪肌肉组织进行脱细胞化处理，引入了异丙醇（IPA）步骤以去除脂质。表征结果显示，IPA处理显著去除了残留脂质，同时很好地保留了胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等关键细胞外基质（ECM）成分，为后续制备高性能生物墨水奠定了基础。
3.2. 骨骼肌特异性生物墨水的黏弹性表征
流变学测试表明，与未经IPA处理的生物墨水相比，IPA处理的MdECM生物墨水表现出更高的黏度、更大的储能模量（G′）、更宽的线性黏弹性区域、更快的结构恢复能力（触变恢复比达94.9%）以及更慢的应力松弛。这意味着该生物墨水具有更强的形状保持能力、机械稳定性和弹性主导的响应，能够更好地抵抗变形并在剪切后恢复，为细胞提供稳定的力学微环境以传递牵引力。
3.3. 通过调节生物墨水浓度和细胞密度以增强柱状框架腔室中的肌管排列和分化
细胞实验发现，2%（w/v）的MdECM生物墨水在保持良好的细胞活性和增殖能力的同时，具有足够的可打印性和稳定性。将载有C2C12细胞的生物墨水注入由两个柱子约束的框架中培养，细胞产生的牵引力与柱子的反作用力相互作用，驱动了构建体的各向同性收缩，并最终引导肌管沿柱子连线方向（纵向）排列。研究进一步发现，较高的细胞密度（1×106和1×107细胞/mL）能产生更强的收缩力，从而实现更显著的构建体面积缩减和更优的肌管排列。
3.4. 通过3D打印柱状框架系统实现肌纤维取向的空间调控和力学成熟
通过3D打印制造不同柱子间距（10， 15， 20 mm）和厚度（1 mm， 3 mm）的框架。研究发现，15 mm的柱子间距能产生最优的肌管排列和最高的极限抗拉强度。柱子厚度会影响柱子附近区域的肌管取向，厚柱子会导致局部取向更分散。此外，研究还展示了一个三柱子直角排列的框架，成功在单个构建体内诱导出了多方向的肌管排列，证明了通过框架设计进行肌纤维空间模式化的可行性。
3.5. 构建可拉伸多腔室生物反应器以增强肌肉块的肌源性成熟
为了模拟运动时的机械刺激，研究团队开发了一个基于Ecoflex材料的可拉伸多腔室生物反应器，能够对多个肌肉块同步施加循环单轴应变。将肌肉块在生物反应器中进行14天分化培养，并施加0%（静态）、10%或20%的循环应变。结果表明，施加10%应变最能促进肌管的成熟：免疫荧光显示肌球蛋白重链（MHC）表达增强且排列整齐；蛋白质印迹和qPCR分析显示肌源性蛋白（如MHC， α-辅肌动蛋白， 肌钙蛋白T）和相关基因（如MyoG， MYF6， MHC亚型）的表达在10%应变组显著上调，而20%过度应变组的效果则减弱。功能上，经过10%应变培养的肌肉块在电刺激下能产生同步的钙瞬变和肉眼可见的收缩，证明了其具备兴奋-收缩耦联能力。
研究结论与意义归纳如下：
本研究成功开发了一种集成化平台，通过增强黏弹性的肌肉源性细胞外基质（MdECM）生物墨水和3D打印辅助的循环应变生物反应器，协同解决了工程化骨骼肌构建中的关键瓶颈。主要结论包括：1. 在脱细胞化过程中引入异丙醇（IPA）处理能有效去除脂质，显著提升MdECM生物墨水的黏弹性、结构稳定性和形状保真度，为细胞提供可有效传递机械力的微环境。2. 利用3D打印的柱状约束框架，可以通过调节柱子几何形状和间距来精确调控肌管的空间排列方向，并影响构建体的最终力学性能。3. 自主研发的可拉伸多腔室生物反应器能够施加可控的循环机械应变，其中10%的适度应变最能促进肌管的分子成熟、结构排列和收缩功能，而20%的过度应变则可能产生抑制效果。
这项研究的重要意义在于：它不仅提供了一种性能优化的肌肉特异性生物墨水配方，更重要的是构建了一个模块化、可扩展且功能整合的实验平台。该平台能够实现从墨水制备、3D成型、机械约束引导到动态力学刺激促成熟的全流程控制，为规模化生产结构功能成熟的骨骼肌微组织铺平了道路。这使其在再生医学（如体积性肌肉损失修复）和高通量药物筛选（针对肌少症、恶病质等肌肉消耗性疾病）领域展现出巨大的应用潜力。尽管在实现完全血管化、神经支配和长期强健收缩功能方面仍面临挑战，但本研究提出的策略为克服这些挑战提供了坚实的技术基础和新的研究方向。
