《United European Gastroenterology Journal》：Paired Duodenal and Salivary Microbiome Analysis in Pancreatic Cancer Without Duct Obstruction
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本研究首次前瞻性地配对分析了无胰胆管梗阻的胰腺导管腺癌（PDAC）患者与健康对照（HC）的唾液及十二指肠刷检样本微生物组。核心发现表明，PDAC与十二指肠系统发育多样性（Faith's PD）的降低以及独特的菌群特征相关，这些改变独立于主要混杂因素。此外，较高的唾液α-多样性（Faith's PD, observed ASVs）与更好的总生存期（OS）相关，提示口腔及十二指肠特定菌属（如 Streptococcus, Actinobacillus, Fusobacterium, Tannerella, Catonella）可能作为PDAC的潜在预后生物标志物，为基于微生物组的干预策略提供了新方向。
引言
胰腺导管腺癌（PDAC）的发病率和死亡率持续上升，尤其是年轻人群。其诊断晚、疗效有限，因此理解肿瘤发生因素并寻找可靠的诊断或预后标志物至关重要。微生物组与PDAC发生发展的关联已被广泛研究，尤其是粪便和口腔微生物组。有假说认为，口腔细菌可能通过主要十二指肠乳头迁移至十二指肠和胰腺，从而促进肿瘤发生。然而，先前大多数关于十二指肠微生物组的研究主要纳入了胰头病变患者，这些患者常伴有胰胆管梗阻或置入支架，其微生物组的改变可能继发于梗阻本身，而非疾病。本研究的主要目的是比较无胰胆管梗阻的PDAC患者与匹配的健康对照之间，配对的口腔（唾液）和十二指肠（刷检）微生物组的差异。次要目的是探索口腔和十二指肠微生物组与患者总生存期（OS）的可能关联。
材料与方法
本研究为一项前瞻性观察性研究，经伦理委员会批准。患者组为初诊、未经任何治疗、临床影像学怀疑为PDAC并行首次诊断性超声内镜（EUS）检查的患者。排除标准包括已置入胆道或胰腺支架、EUS评估存在胰胆管梗阻、或最终细胞学报告为非PDAC肿瘤的患者。健康对照组（HC）为因任何原因接受胃镜检查的患者，排除有食管或胃切除史、已知胰腺疾病、萎缩性胃炎、乳糜泻或肿瘤性疾病的个体。所有参与者在内镜检查前采集血液样本，并排除肝功能异常者以避免混杂。HC按性别和年龄（±2岁）以1:1的比例与PDAC病例匹配。
在镇静和内镜检查前，收集参与者未刺激的唾液样本（4 mL）。十二指肠刷检样本在EUS或胃镜检查过程中，使用胃肠道细胞学刷在距主要乳头3 cm范围内的十二指肠壁进行刷取。所有样本均保存在稳定液中，并由同一实验室进行16S rRNA基因测序分析。微生物组成通过16S rRNA基因测序评估。α-多样性使用Faith‘s系统发育多样性（PD）、观察到的ASV数和Pielou‘s均匀度进行评估；β-多样性使用UniFrac、Bray–Curtis和基于距离的冗余分析（db-RDA）进行评估。使用Cox模型和ROC衍生截断值检验与总生存期的关联，并通过留一法交叉验证评估稳健性。研究进行了样本量计算，确保达到90%的统计效力。
结果
3.1 人口统计学和临床特征
最终分析人群包括24例无导管梗阻的PDAC患者和24例性别年龄匹配的HC，共计96份样本。如表1所示，与HC相比，PDAC组糖尿病患者和牙周炎患者的比例显著更高。其他可能影响微生物组成的因素，如吸烟、质子泵抑制剂（PPI）使用、抗生素、益生菌和漱口水使用，在两组间无显著差异。PDAC患者中，根据NCCN分期，2例（8%）可切除，4例（17%）临界可切除，12例（50%）局部晚期，6例（25%）诊断时已转移。
3.2 微生物组测序数据
对96份样本进行测序，平均每样本获得62，991条高质量序列，共组装出3868个ASV。稀疏曲线显示测序深度足以捕获潜在的微生物多样性。
3.3 十二指肠和唾液微生物组的α-多样性
与HC相比，PDAC患者十二指肠刷检样本的Faith‘s PD显著降低（q = 0.034），表明系统发育广度变窄。然而，丰富度（ASV数）和均匀度无显著差异。在唾液样本中，PDAC与HC之间的任何α-多样性指标均未显示显著差异。在PDAC样本内部，十二指肠刷检的α-多样性（Faith‘s PD和ASV数）显著低于配对的唾液样本。而在HC中，十二指肠与唾液样本的α-多样性无显著差异。Wilcoxon秩和检验的配对比较显示，无论在PDAC还是HC中，唾液的ASV丰富度均高于配对的十二指肠刷检样本，且PDAC组差异更大。
为探究已知影响微生物组的因素是否可解释上述差异，评估了吸烟、糖尿病和PPI使用的影响。在调整了糖尿病和牙周炎的多变量模型中，PDAC患者十二指肠样本较低的Faith‘s PD（q = 0.048）和ASV丰富度（q = 0.029）仍然显著。这表明观察到的PDAC患者十二指肠α-多样性降低并非由这些合并症解释。
3.4 PDAC与对照组唾液和十二指肠刷检样本的β-多样性差异
未加权UniFrac分析显示，在PDAC患者和HC中，十二指肠刷检与唾液样本之间存在显著差异。在同一采样部位（唾液或十二指肠）内部，PDAC与HC之间未观察到显著差异。加权UniFrac和Bray–Curtis相异度也显示了类似结果，即样本部位是β-多样性差异的主要驱动因素。在包含糖尿病、牙周炎和身体部位（唾液或十二指肠）作为协变量的db-RDA多变量模型中，PDAC状态与β-多样性显示出微小但统计学显著的关联（pseudo-F = 2.16, p = 0.002）。身体部位仍然是变异的主要来源。
3.5 区分PDAC患者与HC的微生物类群
差异丰度分析识别出区分组别的特定菌属。Proteobacteria门的 Aggregatibacter在HC的唾液和十二指肠刷检样本中更为丰富。相反，Bacillota门的 Solobacterium和 Stomatobaculum，以及Firmicutes门的 Selenomonas在PDAC患者的十二指肠刷检中比HC更丰富。Firmicutes门的 Megasphaera在PDAC患者的唾液和刷检样本中均更丰富。
3.6 α-多样性和属水平特征与PDAC生存期相关
在PDAC患者中，研究了微生物组特征与总生存期（OS）的关联。ROC分析显示，十二指肠样本的α-多样性预测能力有限。然而，当根据唾液α-多样性对患者进行分层时，较高的多样性在多变量分析（校正年龄和疾病分期后）中与更长的OS相关：Faith‘s PD（aHR = 0.18, p = 0.02）和ASV数（aHR = 0.17, p = 0.03）。留一法交叉验证（LOOCV）显示模型系数稳定，支持了该生存关联的稳健性。
此外，几个菌属在调整年龄和疾病分期后，仍与OS独立相关。在唾液中，较高丰度的 Fusobacterium和 Tannerella与更好的预后相关，而 Streptococcus和 Actinobacillus与更差的生存期相关。在十二指肠刷检中， Catonella在多变量模型中仍与改善的生存期显著相关。
讨论
据我们所知，本研究首次评估了无胰胆管梗阻PDAC患者与匹配对照的配对口腔和十二指肠微生物群。研究发现PDAC与十二指肠系统发育多样性降低相关，表明生态位变窄，且独立于胆汁或胰液流动。这种多样性降低在调整糖尿病和牙周炎后仍然存在。β-多样性主要由样本部位驱动，但多变量分析显示疾病状态对β-多样性有独立影响。研究识别出区分PDAC与HC的特定菌属，其变化模式与潜在的口腔-十二指肠微生物迁移途径相符。
有趣的是，微生物组特征也与PDAC患者的OS相关。唾液（而非十二指肠）较高的α-多样性与更长的OS相关。在属水平，一小部分类群与OS相关，提示特定菌属可能具有预后意义。例如，唾液 Streptococcus和 Actinobacillus丰度较高与死亡风险增加相关，而 Fusobacterium和 Tannerella则与更好结局相关。十二指肠中的 Catonella与改善的生存期相关。
本研究的优势包括允许个体内比较的配对分析、全面的多样性指标评估以及对潜在混杂因素的考量。局限性包括样本量较小、横断面设计以及16S测序在物种分辨率和功能洞察上的限制。十二指肠刷检采样可能存在污染，且缺乏阴性对照。
总之，本研究数据强调了在无导管梗阻的PDAC患者中存在变窄的十二指肠系统发育景观。虽然未显示出强烈的诊断作用，但探索性发现提示口腔微生物组可能的预后关联，并与口腔-十二指肠微生物途径的假说相符。需要更大规模、纵向和多组学研究来验证这些关联，并探索其机制和治疗意义。
