《Environmental Microbiology》：Warming Causes a Decline in Baltic Sea Coastal Sediment Microbial Abundance
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本研究通过在波罗的海一处被核电站冷却水人工加热超过50年的海湾及其邻近对照海湾取样，探究了长期变暖对海洋沉积物微生物群落的影响。研究发现，与预期相反，长期升温并未提高微生物丰度，反而导致沉积物中细菌和古菌细胞数量减少，同时使硫酸盐-甲烷转换带(SMTZ)等生物地球化学层位向表层“变浅”，相关功能微生物群落也随之迁移。这表明未来气候变化可能通过减少作为食物网基石的微生物数量，并增加甲烷等温室气体从海底释放的风险，进而影响整个沿海生态系统的稳定。
研究背景与假说
海洋沿岸生态系统是地球上最具价值的区域之一，尽管仅占海底面积的2%，却是重要的碳汇。然而，由于水柱较浅，热量传递更快，这些区域正遭受来自人为压力，特别是气候变化相关变暖的日益加剧的威胁。微生物是驱动与碳、氮、硫循环相关的全球生物化学过程的关键因子，是生态系统平衡的重要因素。海洋沉积物中的微生物，尤其是细菌，由于孔隙水化学在海底以下的渐进变化，参与了发生在不同沉积深度的这些生物地球化学循环。据估计，海洋中总微生物生物量的75%位于海底上层10厘米的沉积物中。然而，关于气候变暖如何影响沉积物微生物细胞丰度及其死活比例，目前认知尚浅。
波罗的海是一个半封闭的咸水水体。在全球变暖的背景下，波罗的海的升温速度是所有边缘海中最快的。本研究利用一个位于瑞典东南部奥斯卡港附近的海湾，该海湾已被附近的核电站冷却水人工加热超过50年，比一个不受加热影响的邻近对照海湾平均温度高出约5°C。这为研究自然环境下长期升温的影响提供了一个独特的“天然实验室”。之前针对此地的研究显示，长期变暖可能导致底栖微生物多样性下降，同时伴随着更广泛的耐热性和对温度波动响应的减弱，并且微生物群落即使经过了超过50年的暴露，也未完全适应升温，仍表现出与应激相关的RNA转录本增加。此外，升温还导致沉积物地球化学层位变浅，并使得硫酸盐-甲烷转换带(SMTZ)向上迁移。
本研究旨在通过结合基于16S rRNA基因的活/死细胞测量和细胞数量统计，探究氧化还原层的“变浅”是否会改变细菌和古菌细胞在沉积深度上的定量分布和活/死比例。本研究提出的假说是：与气候相关的变暖会增加微生物生产力，从而导致加热海湾的细胞丰度高于对照海湾，且在最浅的沉积层中效应最明显。
研究方法
2.1 野外采样
采样于2023年3月29日至30日及4月6日在瑞典东南部奥斯卡港以北的两个沿岸海湾进行。一个海湾被附近核电站排放的冷却水人工加热超过50年，称为“加热海湾”；另一个海湾不受排放影响，称为“对照海湾”。在每个海湾的四个不同采样点，使用重力采样器采集了沉积物岩芯。岩芯在六个不同的沉积深度被无菌切片，样本被收集在无菌管中。现场还测量了底层水的温度、pH和盐度。
2.2 活/死细胞的碘化丙啶单氮唑鉴定
利用碘化丙啶单氮唑鉴定微生物细胞的活/死状态。PMA可穿透细胞膜受损的细胞，在紫外线照射后不可逆地与细胞DNA结合，从而抑制后续的PCR扩增，因此只有“活”细胞能被扩增。现场分析时，将一份样本与不含PMA的PBS缓冲液混合，另一份样本与含有PMA的缓冲液混合，在黑暗和蓝光下分别孵育后，立即用液氮速冻并运回实验室。
2.3 地球化学分析
对收集的孔隙水样本进行了地球化学参数测量，包括亚硝酸盐、硝酸盐、铁、硫酸盐、铵、磷酸盐和溶解有机碳等，使用分光光度计和相应的试剂盒完成。
2.4 DNA提取
使用商品化试剂盒从PMA处理和未处理的样品中提取DNA，并测量DNA浓度和纯度。
2.5 qPCR扩增
为了进行qPCR分析，为细菌和古菌的引物分别制备了标准品。qPCR分析在专业仪器上进行，用于定量细菌和古菌的16S rRNA基因拷贝数。通过标准曲线计算样本的基因拷贝数，并将其转换为每克沉积物干重中的拷贝数。
2.6 16S rRNA基因扩增与测序
使用特异性引物对细菌和古菌群落的16S rRNA基因进行扩增。扩增子和测序文库的制备按已发表方法进行。在Illumina MiSeq平台上对细菌和古菌的16S rRNA基因扩增子进行了双端测序。
2.7 生物信息学分析
原始测序数据使用专业的生物信息学流程进行分析，包括引物去除、质量过滤、序列处理和分类学注释，以生成扩增子序列变异，并使用标准数据库对细菌和古菌序列进行分类学鉴定。
2.8 数据分析与统计学
使用R语言和相应软件包进行数据分析。通过混合线性模型检验深度和海湾间的差异。将qPCR得到的基因拷贝数与沉积物干重测量结合，计算16S rRNA基因拷贝数/克干重。通过将16S rRNA基因扩增子测序得到的相对丰度百分比乘以qPCR分析得到的相应细菌/古菌基因拷贝数，计算基于细菌和古菌科的绝对细胞数量。通过Wilcox检验等方法比较加热海湾和对照海湾的细胞丰度差异。通过ANCOMBC2软件包在科水平上进行差异丰度分析。使用PICRUSt2工具对细菌和古菌的16S rRNA基因序列进行潜在基因功能的预测，并分析氮、硫、甲烷循环相关基因的差异丰度。
研究结果
3.1 基于16S rRNA基因拷贝的活/死细胞数量
比较PMA处理和未处理的结果，以评估沉积物微生物细胞丰度的活/死比例。在加热海湾和对照海湾，对所有测试深度汇总的细菌PMA处理和未处理结果之间均无显著差异，表明几乎所有的细胞都是活的。古菌细胞的结果也类似，PMA处理与未处理之间无显著差异。因此，在后续分析中将PMA处理与未处理的数据合并。
将加热海湾与对照海湾所有深度的细菌和古菌16S rRNA基因拷贝数汇总后进行比较，发现对照海湾的细胞数量显著高于加热海湾。在加热海湾，细菌和古菌的数量在沉积物最浅层最高，并随深度增加而稳定下降。相比之下，对照海湾的细菌和古菌数量在0-1厘米处较低，在1-2厘米处达到峰值，随后随深度增加而减少。
3.2 基于16S rRNA基因群落的定量分析
将16S rRNA基因相对丰度与基于qPCR的细胞数量相结合，得到了两个海湾中各个分类群的绝对丰度。无论是否添加PMA，对照海湾的16S rRNA基因ASVs主要归属于Coleofasciculaceae、Illmatobacreaceae、Thiabacillaceae和JAFDCJ01等细菌科。而加热海湾的ASVs则主要归属于Hyphomicrobiaceae、B3-Chlor和UBA8346等细菌科。这些科在加热海湾的丰度较低。例如，Illumatobaceraceae的数量在加热海湾的前2厘米最高，并向更深深度急剧下降。
在古菌方面，无论是否添加PMA，对照海湾的古菌TCS64家族的细胞丰度从1厘米沉积深度以下被检测到。EX4484-6家族的丰度在1-2厘米层达到峰值，在5-6厘米、8-10厘米和15-17厘米层下降。加热海湾的丰度也以TCS64和EX4484-6家族为主，表现出类似的模式。
3.3 基于16S rRNA基因的群落随沉积深度的差异丰度
差异丰度分析显示，在加热海湾和对照海湾，浅层和深层沉积物中的微生物群落存在差异。在加热海湾，具有多种碳代谢功能的古菌科BA1的相对丰度从8厘米到24厘米深度显著增加。而产甲烷古菌科Methanomethylophilaceae在8-24厘米深度的相对丰度显著降低。古菌科EX4484-6从表层到深层（5-24厘米）的丰度也明显降低。相反，HEL-GB-A家族在8-24厘米的丰度显著增加。JACRNV01家族的丰度在8-17厘米也显著增加。
在细菌群落方面，34-128家族的丰度在8-24厘米深度显著增加。蓝细菌科Coleofasciculaceae和Cyanobiaceae的丰度在15-17厘米和22-24厘米深度显著降低。两个硫酸盐还原菌科表现出不同模式：Desulfocapsaceae在22-24厘米的丰度显著降低，而UBA11574在8-10厘米的丰度显著增加。
在对照海湾，表层与深层微生物家族之间的差异普遍不那么显著。古菌BA1家族仅在22-24厘米深度显示出显著增加的相对丰度。Methanomethylophilaceae在22-24厘米深度显著降低。古菌Nitrosopumilaceae家族在15-24厘米深度显著降低。在细菌群落方面，34-128家族在15-17厘米和22-24厘米深度显著增加。来自Anaerolineae纲的JAAYZQ01和UBA4823两个家族在15-17厘米和22-24厘米的丰度也显著增加。相反，Desulfocapsaceae家族在15-17厘米和22-24厘米的丰度显著降低。
3.4 预测基因功能的差异丰度
对PICRUSt2预测的参与氮、硫和甲烷循环的基因进行分析。总体而言，在两个海湾的细菌和古菌中，选定的基因类别在0-1厘米表层与1-2厘米、5-6厘米深度之间观察到的统计学显著差异很少。
在加热海湾8-10厘米深度区，与产甲烷作用相关的基因在深层相较于表层有显著增加的log折叠变化，硫循环的二甲基硫醚基因也有类似趋势。这些预测的基因拷贝数在加热海湾的深层也显著更高。而大多数氮循环和氧化硫循环基因在深层显示出显著较低的丰度。在对照海湾，从15厘米到24厘米的深层沉积物开始出现类似模式，显示出总体相似的预测基因丰度，但两个海湾基因丰度开始下降的深度不同。
对于预测的古菌基因，在加热海湾最低的22-24厘米深度，与甲烷循环相关的基因显示出显著更高的相对丰度。而在对照海湾，与甲烷和硫循环相关的预测古菌基因在15-17厘米和22-24厘米深度则显著较低。
3.5 地球化学参数与基于16S rRNA基因的微生物群落关系
对照海湾的平均底层水温度、pH和盐度分别为4.9°C、pH 8.48和10.89 mS/cm。加热海湾的平均值分别为7.3°C、pH 8.32和11.64 mS/cm。两个海湾之间的底层水温度存在显著差异。对沉积物深度梯度孔隙水中的硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、铵、有机物和溶解无机碳进行了测量。硫酸盐在总体上没有表现出海湾间的显著差异，但沿着沉积深度梯度，海湾之间存在显著的交互作用差异。另一个显示海湾间显著差异的变量是溶解无机碳。其他地球化学参数在海湾间或沿深度梯度上未显示出显著差异。
讨论
温度升高，例如由于气候变化，会导致微生物代谢率提高，进而导致细胞复制率增加。尽管如此，基于qPCR的分析并未显示加热海湾的细胞数量相对于对照海湾因温度升高而增加。相反，尽管有超过50年的时间来适应升高的温度，但长期变暖导致加热海湾的微生物细胞数量比对照海湾更少。这可能是由于部分可用能量被转移到应对热应激，而不是用于细胞复制。此外，微生物丰度通常也随沉积深度增加而减少，这是由于电子供体可用性降低以及厌氧呼吸伴随的能量保存效率较低。因此，加热海湾细胞数量下降得更快，也可能与厌氧反应发生在更靠近沉积物表面有关，即地球化学区带的“变浅”。总之，更高的温度增加了微生物的代谢率，但这并未转化为加热海湾细菌细胞数量的增加。这表明，尽管变暖会提高代谢率，但气候变化可能会影响微生物细胞数量及其所执行的生物化学过程，从而对整个生态系统的食物网产生级联效应。
关于活细胞和死细胞的PMA相关调查显示，在两个海湾中，PMA处理和未处理样本之间没有统计学差异。尽管这可能是一个有效的结果，但高度的变异，特别是在对照海湾的PMA未处理样本中，可能掩盖了任何差异。活细胞总数缺乏差异，可能是因为诸如捕食者和病毒等导致细菌死亡的重要因素在沉积物中不起重要作用，从而导致持续活跃细胞的比例较高。缺乏差异的另一个潜在原因可能是由于温度升高导致的代谢率提高，以及使用死细胞物质来产生能量。此外，PMA处理方案对于含有沉积物颗粒的未处理海洋沉积物样本可能需要特定调整。
细菌和古菌的16S rRNA基因扩增子结果与之前在两个海湾的发现一致，显示了微生物群落随深度的变化。总体而言，在较高温度下，沉积层之间的分类群差异更大，尤其是在深层。一些产甲烷菌和硫酸盐还原菌在长期变暖的沿海水域中，丰度变化发生在更靠近沉积物表面的位置。例如，氢营养型产甲烷菌BA1在加热海湾沉积物表面以下1-2厘米处丰度增加，而在对照海湾则在15厘米深度才观察到。这些数据支持了由于地球化学层整体“变浅”，硫酸盐-甲烷转换带向沉积物表面移动。SMTZ在沿海地区向沉积物表面变浅，增加了甲烷通过扩散逃逸并进入水柱的机会。总体而言，在加热海湾，基于16S rRNA基因鉴定出的产甲烷菌和硫酸盐还原菌在更浅的位置出现，证实了SMTZ向沉积物-水界面转移，并增加了甲烷释放到底栖水体的风险。
将基于16S rRNA基因的分类学与定量细胞数相结合，在加热海湾的沿海沉积物中没有显示出清晰的模式。然而，在加热海湾表层沉积物中观察到古菌EX4484-6的丰度较高，而该家族在对照海湾仅出现在更深深度。这进一步支持了地球化学层“变浅”、上层沉积物中微生物活动性更高，以及长期变暖导致的微生物群落迁移。与加热海湾缺乏清晰模式相反，在环境对照海湾中观察到Coleofasciculaceae和TCS64的明显优势。蓝细菌的高丰度支持了先前的结果。对照海湾沉积物中最丰富的古菌是未培养的TCS64家族，其丰度随沉积深度增加而增加，支持了它是海洋沉积物群落中主要类群的先前报道。其丰度在表层较高的原因之一可能与甲烷代谢有关，以及SMTZ的迁移，因为这些古菌通常在表层深度丰度较高。最后，基于PICRUSt2对潜在功能和能量来源的预测，再次支持了16S rRNA基因扩增子数据中观察到的微生物群落变化。一个重要的区别是，预测的电子受体在加热海湾沉积物中从氮到硫，最后到甲烷的转变，发生在比对照海湾更浅的深度。所有这些数据都支持先前的研究，即由于长期持续的升温，与硫和甲烷能量循环相关的RNA基因转录本表达在更靠近沉积物表面的地方增加。
结论
本研究通过分析波罗的海一个被长期人工加热的海湾，揭示了气候变暖对沿海沉积物微生物群落的深远影响。与升温会提高微生物生产力的常见假设相反，研究发现长期变暖（>50年，平均升高5°C）导致了沉积物中细菌和古菌总细胞丰度的显著下降。这可能是由于微生物将更多能量用于应对热应激，而非细胞增殖。同时，变暖加速了沉积物中的生物地球化学过程，导致硫酸盐-甲烷转换带等关键氧化还原界面“变浅”，相关的功能微生物群落也向表层迁移。具体表现为，产甲烷古菌和硫酸盐还原菌在加热海湾更浅的深度出现更高的相对丰度，这增加了甲烷从沉积物释放到水柱乃至大气的风险。该研究预示，未来气候变暖可能通过削弱沿海沉积物的碳封存能力、改变微生物驱动的元素循环、并减少作为海洋食物网基石的微生物数量，对波罗的海乃至全球类似的沿海生态系统产生级联式负面影响。
