《The FASEB Journal》：TNXB Regulates Spermatogenesis by Maintaining Cytoskeleton and Cell Junction Stability
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本文揭示了细胞外基质糖蛋白Tenascin-X (TNXB)在睾丸结构和精子发生中的关键作用。研究发现，在非梗阻性无精子症患者睾丸中TNXB显著下调，而条件性敲除小鼠模型证实，TNXB缺失会导致睾丸萎缩、生精小管退化、生殖细胞大量凋亡以及精子数量与活力下降。机制研究表明，TNXB与IV型胶原相互作用，并对于维持细胞骨架结构、紧密连接组织和血睾屏障完整性至关重要。该研究为理解男性不育的分子机制提供了新的视角。
摘要
Tenascin-X (TNXB)是一种细胞外基质糖蛋白，在结缔组织中具有结构和调节作用，但其在睾丸发育和精子发生中的病理生理作用尚未明确。本研究首次发现TNXB与人类精子发生障碍相关：通过基于同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)的蛋白质组学分析，在非梗阻性无精子症患者的睾丸中，TNXB表达显著下调。在小鼠中的发育谱分析显示，随着睾丸成熟，TNXB表达逐渐增加，并主要定位于生殖细胞。为了阐明其在精子发生中的功能，研究者利用Cre-LoxP系统，构建了生殖细胞特异性敲除Tnxb基因的条件性基因敲除小鼠模型。结果显示，Tnxb缺失导致睾丸尺寸减小、严重的生精小管退化、过度的生殖细胞丢失、精子发生受损，以及精子数量和活力下降。对敲除小鼠睾丸的转录组分析表明，失调的基因主要与减数分裂、生殖细胞发育、细胞骨架与紧密连接的组织以及细胞连接组装相关。进一步的实验证实，在敲除小鼠睾丸中，调控细胞骨架、细胞连接和细胞外基质组织的关键蛋白存在错误定位和表达改变。值得注意的是，TNXB被发现与细胞外基质的关键成分IV型胶原存在相互作用。Tnxb的缺失导致支持细胞骨架与连接结构之间的关联异常。这些发现证实，TNXB对于维持睾丸内细胞外基质、细胞骨架和细胞连接三者之间的完整性及相互作用不可或缺，其缺陷会损害睾丸结构并影响精子发生。
引言
精子发生是一个高度有序且受时间调控的过程，涉及精原干细胞的增殖、分化、减数分裂并最终转化为成熟精子。这一复杂过程发生在睾丸的生精上皮内，依赖于发育中的生殖细胞与支持细胞之间紧密的物理和生化相互作用。这些相互作用的完整性取决于一个由细胞间连接、细胞骨架结构和提供结构支持与空间信号的细胞外基质组成的复杂网络。其中任何一个组分的破坏都可能导致生精失败和男性不育。TNXB属于tenascin家族，是一种大型细胞外基质糖蛋白，以其调节胶原纤维生成、组织弹性和细胞-基质相互作用的能力而闻名。然而，其在生殖生物学，特别是在睾丸中的功能，在很大程度上仍未被探索。本研究旨在通过整合临床蛋白质组学数据、发育表达谱和功能性遗传学方法，探究TNXB在男性生殖中的作用。
TNXB表达与人类生精障碍及小鼠睾丸成熟相关
为筛选与生精缺陷相关的基因，研究者获取了非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症患者的睾丸活检组织进行蛋白质组学分析。在差异表达的蛋白中，TNXB在非梗阻性无精子症组中的蛋白水平显著低于对照组。小鼠发育谱分析则显示，在野生型小鼠中，TNXB在睾丸中的表达随年龄增长而严格上调，从出生后第1天到第56天呈渐进性积累，在性成熟时达到峰值。免疫组织化学定位显示TNXB富集在生精小管的基底外侧细胞外基质区室，其染色强度从新生儿的微弱到成年期小管周围的强沉积逐渐增强。免疫荧光染色进一步表明，睾丸中的TNXB与DDX4阳性的生殖细胞明显共定位。
构建生殖细胞特异性Tnxb敲除小鼠模型
为了鉴定TNXB在生殖细胞发育中的作用，研究者利用Ddx4-Cre小鼠构建了Tnxb条件性基因敲除小鼠。基因型鉴定和定量PCR及免疫印迹分析均证实，在敲除小鼠的睾丸中，Tnxb的mRNA和蛋白水平均显著降低，表明Tnxb基因在生殖细胞中被成功敲除。
TNXB是维持睾丸结构与精子发生所必需的
宏观形态观察显示，与对照组相比，敲除小鼠的睾丸尺寸显著减小，睾丸绝对重量和相对于体重的比值也显著降低。通过计算机辅助精液分析发现，敲除小鼠的精子浓度、总活力、前向运动活力以及快速和慢速前向运动精子的百分比均急剧下降。组织病理学检查揭示了敲除小鼠生精小管的三种类型病变：空泡化、管腔阻塞和管腔缩窄，这些病理变化的比例在敲除睾丸中均显著增加。细胞凋亡检测和生殖细胞定量分析表明，敲除小鼠生精小管内的凋亡细胞显著增加，而DDX4阳性的生殖细胞数量显著减少。此外，减数分裂标记基因表达分析和SYCP3免疫染色显示，敲除小鼠睾丸中减数分裂精母细胞积累，表明存在减数分裂阻滞。
Tnxb缺失导致参与精子发生基因表达的深刻变化
对敲除和对照组小鼠睾丸进行RNA测序分析，共鉴定出477个差异表达基因。基因本体富集分析显示，这些基因显著富集于联会复合体、生殖细胞和精子细胞发育、精子发生、紧密连接组织、细胞粘附、肌动蛋白细胞骨架组织和细胞间连接组织等生物过程。京都基因与基因组百科全书通路富集分析表明，上调基因主要参与亨廷顿病、氧化磷酸化和核糖体等通路，而下调基因则富集于细胞骨架相关通路。多个在染色质重塑、细胞骨架稳定性和精子发生中具有已知作用的关键基因表达出现显著失调。
Tnxb缺失导致精子发生相关基因在mRNA和蛋白水平显著下调
通过定量PCR和蛋白质印迹分析进一步验证了转录组数据。结果显示，一些与细胞骨架组织和细胞粘附相关的候选基因（如Myh7、Fgfr3、Pcdh8、Vill）在敲除小鼠睾丸中的mRNA和/或蛋白水平显著降低。免疫荧光分析证实，MYH7蛋白在敲除睾丸中的信号强度和空间分布均出现异常。
Tnxb敲除破坏睾丸中关键细胞骨架和连接蛋白的表达与分布
免疫荧光分析检测了多种关键细胞骨架和连接蛋白的定位与表达。在敲除小鼠睾丸中，微管标记物α-微管蛋白的规则排列被破坏；精子鞭毛标记物乙酰化微管蛋白的信号显著减少；紧密连接蛋白ZO-1和ZO-2的分布变得不连续且减少；粘附连接组分β-连环蛋白的分布出现扩展且极性丧失；IV型胶原沿基底膜的连续性被破坏；支持细胞骨架蛋白波形蛋白的丝状结构变得紊乱。体内生物素示踪实验表明，敲除小鼠的血睾屏障完整性受损。蛋白质印迹分析进一步证实，ZO-1和ZO-2的蛋白水平显著下降，而β-连环蛋白和N-钙黏蛋白的水平升高。最后，免疫共沉淀实验显示，TNXB与IV型胶原存在明确的相互作用。
讨论
本研究揭示了一个先前未被认识的TNXB在调节精子发生和维持睾丸结构中的作用。TNXB功能障碍与破坏生精上皮内支撑生殖细胞-支持细胞相互作用的结构框架有关。研究证实了TNXB与IV型胶原之间存在物理相互作用，这为TNXB在基底膜组织中的直接功能提供了机制性证据。考虑到基底膜、支持细胞骨架和血睾屏障完整性之间密切的功能关联，TNXB与细胞外基质相互作用的破坏很可能导致了观察到的细胞骨架紊乱和连接不稳定。综合而言，研究结果证实了一个模型：TNXB通过维持细胞外基质组织以及生精上皮内协调细胞骨架排列、细胞连接完整性和血睾屏障功能所必需的结构环境，来促进精子发生。TNXB的破坏导致生殖细胞存活受损、生精过程缺陷和精子产量下降。这些结果揭示了TNXB在男性生殖生物学中的一个新角色，并暗示TNXB功能障碍可能对人类男性不育有贡献。
