《FEBS Open Bio》：PARP inhibitors induce a senescence phenotype in non-small cell lung carcinoma cell lines
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本文综述深入探讨了PARP抑制剂（PARPi）在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中诱导治疗诱导衰老（TIS）的机制。研究揭示了不同PARPi（如Talazoparib、Olaparib等）诱导衰老的效力差异，并阐明PARP1蛋白的存在是Talazoparib诱导衰老所必需的，而非其催化活性。文章进一步探讨了衰老相关分泌表型（SASP）的双重作用，并评估了衰老溶解药物Navitoclax（ABT-263）与PARPi联用以清除衰老癌细胞、增强抗癌疗效的潜力，为优化肺癌治疗策略提供了新见解。
引言
聚ADP核糖聚合酶（PARP）家族参与DNA损伤反应（DDR），其中PARP1是核心成员。PARP抑制剂（PARPi）通过竞争性抑制NAD+结合位点，阻止聚ADP核糖（PAR）聚合物形成，从而干扰DDR。值得注意的是，其细胞毒性主要源于将PARP1“捕获”在染色质上，形成有毒的PARP-DNA复合物。不同PARPi（如Talazoparib、Niraparib、Olaparib、Rucaparib、Veliparib）在“捕获”能力和诱导衰老的效力上存在差异，Talazoparib被证明是最强的PARP1抑制剂和“捕获”剂。
细胞衰老是一种不可逆的增殖停滞状态，可由抗癌治疗诱导，称为治疗诱导衰老（TIS）。衰老细胞具有特征性表现：形态增大、核膜完整性受损（表现为核纤层蛋白B1（LMNB1）表达下降）、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性升高，并通过上调Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白抵抗凋亡。此外，衰老细胞通过分泌衰老相关分泌表型（SASP），包括多种细胞因子、趋化因子和活性氧（ROS）等，对周围微环境产生促肿瘤或抗肿瘤的双重影响。因此，识别诱导衰老的抗癌疗法，并利用衰老溶解药物（Senolytics，如Navitoclax）或衰老形态药物（Senomorphics）靶向清除或调控衰老细胞，成为提高抗癌疗效的新策略。
材料与方法
本研究使用了三种非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系：A549、H460和Calu-1。A549和H460细胞为TP53野生型，而Calu-1细胞存在TP53纯合缺失。实验采用了五种临床相关PARPi：Veliparib、Rucaparib、Olaparib、Niraparib和Talazoparib，以及衰老溶解药物Navitoclax。通过细胞计数评估增殖抑制，SA-β-Gal染色检测衰老细胞比例，免疫印迹分析PARP1、pADPr和p53蛋白水平，实时定量PCR（RT-qPCR）检测相关基因（如CDKN1A/p21、MKI67、LMNB1及SASP因子CCL2、IL6等）的mRNA表达，细胞核DAPI染色测量核面积，EdU掺入实验评估细胞增殖活性，MTT法测定细胞活力。此外，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了PARP1敲除（KO）的A549细胞系，以验证PARP1在衰老诱导中的作用。
结果
Talazoparib在非小细胞肺癌细胞系中诱导细胞衰老
用1 μM Talazoparib处理A549、H460和Calu-1细胞6天后，细胞增殖受到显著抑制。三种细胞系均表现出SA-β-Gal阳性细胞比例显著增加，其中A549细胞的比例从几乎为0%升至76%，H460和Calu-1细胞也分别达到约50%和61%。同时，细胞核面积显著增大，这是衰老细胞的典型形态特征。在基因表达水平上，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A/p21）的mRNA表达在三株细胞中均显著上调，而增殖标志物MKI67和核膜完整性相关基因LMNB1的mRNA表达在H460细胞中显著下调。有趣的是，在Calu-1细胞（TP53缺失）中，未观察到MKI67和LMNB1的下调，提示p53可能参与了部分衰老特征的通路调控。在A549细胞中，Talazoparib处理增加了p53蛋白丰度，但在H460细胞中则没有，表明不同细胞系对PARP抑制的响应存在异质性。综合这些结果，Talazoparib在NSCLC细胞中成功诱导了以增殖停滞、SA-β-Gal活性升高和核面积增大为特征的衰老表型。
不同PARP抑制剂诱导细胞衰老的效力存在差异
比较五种PARPi（均使用5 μM浓度）处理6天后的效果发现，它们对细胞增殖的抑制程度不同：Talazoparib和Niraparib抑制作用最强，Olaparib和Rucaparib次之，Veliparib最弱。MTT实验也证实Talazoparib和Niraparib的细胞毒性最强。在诱导SA-β-Gal阳性细胞方面，Talazoparib在三种细胞系中均能最显著地提高其比例。Niraparib、Olaparib和Rucaparib在A549和H460细胞中也能显著诱导SA-β-Gal阳性，但在Calu-1细胞中，仅Niraparib和Talazoparib有效。基因表达分析显示，Talazoparib处理能显著上调H460和Calu-1细胞中CDKN1A的表达，并下调A549和H460细胞中MKI67的表达，以及H460细胞中LMNB1的表达。此外，对SASP相关基因（CCL2、CCL5、CXCL10、IL6、IL8）的表达分析显示，其诱导模式在三株细胞间存在异质性。这些结果表明，不同PARPi诱导衰老的能力并不相同，Talazoparib是其中最强的诱导剂。
PARP1催化活性的抑制并非衰老表型差异的原因
为了探究衰老表型差异是否源于对PARP1催化活性的抑制程度不同，研究检测了pADPr（PAR聚合物）的形成。免疫印迹结果显示，使用5 μM浓度的五种PARPi处理6天后，在H460和Calu-1细胞中均能完全抑制pADPr的形成；在A549细胞中，虽然Veliparib和Rucaparib对部分低分子量蛋白的PAR化抑制不完全，但总体催化抑制效果相似。这表明，不同PARPi诱导衰老能力的差异并非由于它们抑制PARP1催化活性的效力不同。
PARP1的存在是诱导衰老所必需的
为了明确PARP1蛋白本身在衰老诱导中的作用，研究使用CRISPR/Cas9技术构建了PARP1敲除的A549细胞系。在未经处理的条件下，PARP1敲除细胞并未自发出现衰老表型（SA-β-Gal阳性比例与野生型相当）。然而，当用Talazoparib处理时，PARP1敲除细胞中SA-β-Gal阳性细胞比例、增殖抑制（EdU阳性减少）程度、以及CDKN1A的上调、MKI67和LMNB1的下调幅度，均显著低于野生型细胞。这一关键结果表明，Talazoparib诱导衰老并不依赖于其对PARP1催化活性的抑制，而是需要PARP1蛋白本身的存在。一种合理的假设是，PARPi诱导的衰老与PARP1被“捕获”在DNA上形成的毒性复合物有关。
Navitoclax可在PARP1存在下与Talazoparib产生协同作用
研究进一步评估了衰老溶解药物Navitoclax与Talazoparib联用的效果。在野生型A549细胞中，Talazoparib单独处理导致约90%的细胞呈SA-β-Gal阳性，而联合使用Navitoclax后，该比例急剧下降至22%，同时活细胞数量也显著减少。在PARP1敲除细胞中，Talazoparib单独诱导的SA-β-Gal阳性比例本就较低（约20%），联用Navitoclax后进一步降至5%以下，但活细胞数量的减少幅度不如野生型细胞显著。基因表达分析也显示，联合用药能更有效地逆转CDKN1A的上调。这些结果说明，Navitoclax能够有效清除由Talazoparib诱导产生的衰老癌细胞，且这种协同杀伤作用在很大程度上依赖于PARP1的存在。
讨论
本研究系统性地揭示了不同PARPi在NSCLC细胞中诱导衰老的效力存在显著差异，其中Talazoparib是最强的诱导剂。这一现象与p53状态不完全相关，因为在TP53野生型（A549、H460）和缺失型（Calu-1）细胞中，Talazoparib均能诱导衰老，尽管部分下游标志物（如LMNB1、MKI67）的响应存在差异。研究排除了PARP1催化活性抑制是主要驱动因素的可能性，因为所有测试的PARPi在抑制pADPr形成方面效果相似。关键实验证明，PARP1蛋白本身的存在是Talazoparib诱导衰老所必需的，支持了“PARP1-DNA捕获复合物”在触发衰老信号通路中起核心作用的假说。
研究的另一个重要发现是，衰老溶解药物Navitoclax能够与Talazoparib协同，有效清除由此产生的衰老癌细胞，从而增强总体细胞杀伤效果。这为克服因治疗诱导衰老而可能导致的治疗抵抗或肿瘤复发提供了潜在策略。然而，研究也存在一些局限性，例如PARPi诱导的衰老表型在体内肿瘤模型中是否成立尚需验证，以及联合疗法在动物模型和临床中的疗效与安全性有待进一步评估。
总之，该研究深化了对PARPi作用机制的理解，强调了在抗癌治疗中评估其诱导衰老副作用的重要性，并为通过联合使用衰老靶向药物来优化PARPi疗效、开发新的肺癌治疗组合方案提供了重要的实验依据。未来，深入了解癌症背景下衰老的异质性及其调控网络，将为肿瘤患者开辟新的治疗途径。
