《Journal of Extracellular Biology》：Extracellular Vesicle Properties and Functions Are Defined by the Originating Cell's Fitness Status
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本研究揭示了细胞活性状态（活细胞与凋亡细胞）如何影响胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的理化性质、蛋白质组成及其免疫调节功能。通过曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni, S. mansoni）感染模型，研究发现凋亡T细胞来源的EVs（aT-EVs）能显著改善感染期间肝细胞损伤，并激活巨噬细胞（Macrophages, Mφs）的一氧化氮（Nitric Oxide, NO）通路，促进成纤维细胞的体外伤口愈合。这强调了“细胞活性”作为决定EVs功能的关键因素，对理解免疫调控及开发基于EVs的治疗策略具有重要意义。
细胞死亡在调节免疫功能和塑造局部微环境中的作用是近年研究热点。细胞凋亡时会释放多种胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs），如外泌体、微囊泡，并通过膜出芽形成凋亡小体。尽管对EVs的研究兴趣日增，但源于凋亡细胞与活细胞的EVs在功能上的差异仍知之甚少。本研究旨在探讨活细胞与凋亡细胞来源的EVs（ApoEVs）在体外及曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni, S. mansoni）感染急性期的不同特征与功能。
研究首先聚焦于曼氏血吸虫感染小鼠的肝脏。该感染以寄生虫卵聚集导致大量细胞死亡为特征。研究者从感染小鼠肝脏中分离了EVs，发现与未感染（na?ve）小鼠相比，感染肝脏来源的EVs浓度增加了10倍，并且富含免疫细胞相关表面标志物（如CD45、CD11b、MHC-II）。流式细胞术分析显示，感染肝脏中多种免疫细胞（B细胞、T细胞、中性粒细胞等）的凋亡（Annexin V+）数量显著增加。蛋白印迹（Western blot）分析进一步证实，感染肝脏EVs富含凋亡标志物组蛋白H3和剪切PARP（cPARP），表明感染肝脏的EVs富集于源于凋亡细胞的囊泡。miRNA测序发现，宿主（小鼠）来源的miRNA占绝大多数，提示分离到的EVs主要来源于宿主细胞。
为了深入比较活细胞与凋亡细胞来源EVs的特性，研究以胸腺细胞（thymocytes）为模型，分别从其活细胞（liveT）和凋亡细胞（aT）上清中分离EVs。通过透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）发现，凋亡胸腺细胞释放的EVs（aT-EVs）通常更多且尺寸更大。表面标志物分析显示，aT-EVs与活细胞来源EVs（liveT-EVs）的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PtdSer）表达水平相似，表明PtdSer是EVs的通用标志物，而非区分细胞活性状态的可靠指标。然而，关键的凋亡执行蛋白——剪切胱天蛋白酶-3（cleaved CASPASE-3, cCASP-3）在aT-EVs（尤其是小EVs）中含量显著更高，使其成为区分ApoEVs的潜在特异性标志物。进一步的蛋白质组学分析证实，liveT-EVs与aT-EVs的蛋白组成存在显著差异，aT-EVs富集了与炎症反应、凋亡及EV生物发生相关的蛋白。
接下来，研究探讨了这些特性不同的EVs在体内的功能影响。在曼氏血吸虫感染小鼠模型中，于感染后第6周和第7周分别静脉注射aT-EVs、liveT-EVs或PBS对照。结果显示，尽管EV注射未影响肝脏中寄生虫卵的数量或肝脏的总体组织学结构，但与PBS对照组相比，注射aT-EVs的小鼠血清中反映肝细胞损伤的丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransaminase, ALT）水平显著降低，提示aT-EVs具有减轻肝细胞损伤的保护性作用。流式分析未发现肝脏巨噬细胞（Mφs）的极化标志物（iNOS、ARG1、YM1）发生显著改变，蛋白印迹也未检测到肝脏组织整体凋亡水平（cCASP-3与cPARP表达）的差异。
在体外，研究探索了不同靶细胞对EVs的摄取及其功能反应。用CFSE标记的EVs与肝细胞、成纤维细胞和骨髓来源巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDMs）共培养发现，这些细胞均能有效摄取EVs，但摄取偏好不同：BMDMs和成纤维细胞有更多摄取liveT-EVs的趋势，而肝细胞则优先摄取aT-EVs。摄取EVs的细胞（CFSE+）显示出更高的增殖标志物Ki67表达。然而，aT-EVs中富集的cCASP-3并未被检测到转移至靶细胞内。功能上，aT-EVs（而非liveT-EVs）能特异性增强成纤维细胞的体外划痕愈合能力。
对靶向巨噬细胞的分子机制进行深入分析，BMDMs与aT-EVs或liveT-EVs共培养24小时后进行RNA测序（RNA-Seq）。结果显示，aT-EVs处理组中，编码诱导型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS）的Nos2基因以及Cish、Serpinb2等基因表达显著上调。基因本体（Gene Ontology, GO）分析表明，aT-EVs处理的BMDMs上调了与一氧化氮产生相关的通路。这些结果在蛋白水平（流式检测iNOS表达增高）和功能上（通过化学发光法检测到经LPS或PMA刺激后，aT-EVs处理的BMDMs产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）能力更强）得到了验证。值得注意的是，从感染小鼠肝脏分离的EVs也能诱导BMDMs表达更高水平的iNOS，这与感染肝脏EVs中促炎性miR-155的富集现象一致。这些发现揭示了ApoEVs一种先前未被充分认识的促炎功能，这与完整凋亡细胞被巨噬细胞感知后通常诱导抗炎反应的现象形成对比。
综上所述，本研究阐明了细胞活性状态是决定EVs性质和功能的关键因素。凋亡细胞来源的EVs具有独特的物理特性、蛋白组成和生物活性，例如能够减轻曼氏血吸虫感染中的肝损伤、增强成纤维细胞的伤口愈合能力，并激活巨噬细胞的NO通路，从而发挥促炎作用。这些发现不仅增进了我们对EVs在免疫调节中作用的理解，也凸显了在开发基于EVs的治疗策略时，考虑其来源细胞“健康状况”的重要性。
