《Journal of Extracellular Vesicles》：T-Cell-Derived Exosomes From Multi Core Granules Exhibit Superior Caspase-3-Mediated Tumor-Suppressive Activity Compared to Those From Multivesicular Bodies
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这篇研究性论文深入揭示了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）来源外泌体的亚细胞起源、释放动力学及功能异质性。研究发现CTL的外泌体不仅源于经典的多泡体（MVB），还可来自新近发现的多核心颗粒（MCG）。通过先进的显微成像技术，作者证实MCG来源外泌体在免疫突触（IS）以刺激依赖性方式释放，且与MVB来源外泌体相比，其尺寸和四跨膜蛋白（如CD63、CD81）组成高度异质。功能上，MCG来源外泌体展现更强的细胞毒性，能通过caspase-3依赖的机制高效诱导肿瘤细胞凋亡。该研究为CTL介导的免疫应答机制提供了新见解，并为开发基于外泌体的新型免疫疗法奠定了基础。
外泌体在细胞毒性T淋巴细胞中的起源、异质性及肿瘤抑制功能
摘要
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）来源的小型胞外囊泡（sEV）被认为是抗肿瘤免疫的潜在介质，但其亚细胞起源和功能特性尚未完全阐明。本研究系统探究了源自小鼠原代CTL的外泌体，发现它们不仅来源于经典的多泡体（MVB），也源自最近描述的多核心颗粒（MCG）。值得注意的是，MCG来源的外泌体展现出比MVB来源外泌体高五倍的细胞毒活性，并通过caspase-3依赖机制诱导肿瘤细胞凋亡。这些发现揭示了CTL利用不同的分泌途径释放具有不同细胞毒能力的异质性外泌体群体，为开发新型外泌体免疫疗法提供了基础。
1 引言
CTL是适应性免疫的核心，负责清除病毒感染和恶性细胞。其细胞毒活性通过形成免疫突触（IS）启动，并释放穿孔素、颗粒酶（Gzms）、Fas配体和干扰素-γ等效应分子。这些分子被包装在裂解性颗粒中，后者包括单核心颗粒（SCG）和多核心颗粒（MCG）两种亚型。SCG含有均质、高电子密度的核心，以可溶形式释放Gzms和穿孔素。MCG则含有多个称为超分子攻击颗粒（SMAPs）的小电子致密核心。此前研究表明，除SMAPs外，MCG也含有腔内囊泡（ILVs），提示其可能作为外泌体的来源之一，与经典的MVB并存。然而，针对CTL来源外泌体，特别是其细胞起源、组成和功能的研究仍存在显著空白。
2 材料与方法
研究使用野生型（WT）、颗粒酶B（GzmB）-mTFP基因敲入（KI）以及Munc13-4基因敲除（KO）小鼠。从脾脏分离并活化CD8+T细胞以获得CTL。采用差速超速离心结合蔗糖密度梯度离心法从CTL培养上清中分离纯化外泌体。利用相关光电子显微镜（CLEM）、结构光照明显微镜（SIM）和全内反射荧光显微镜（TIRFM）等技术进行亚细胞定位和释放动力学分析。通过纳米液相色谱-质谱联用（nano-LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析。使用流式细胞术评估外泌体对P815肿瘤细胞的细胞毒作用（通过caspase-3激活和碘化丙啶（PI）染色检测）。
3 结果
3.1 CD63在鼠CTL中与颗粒酶B阳性细胞器共定位
SIM和CLEM分析显示，在鼠CTL中，四跨膜蛋白CD63不仅定位于MVB，也定位于GzmB+的细胞器（包括SCG和MCG）。而CD81的表达更为局限，仅与含有ILV的MVB和MCG相关，在SCG中未检测到信号。这表明CD63是MVB和细胞毒颗粒的通用标记物，而CD81是ILV细胞器更特异的标记物。
3.2 CD63阳性外泌体从MCG释放
通过TIRFM分析CTL过表达CD63-SEP和GzmB-pHuji后的融合事件，发现CD63+GzmB+的融合事件表现出较长的荧光衰减时间（>2秒），表明CD63+外泌体与GzmB+的SMAPs共同从MCG中释放。而快速衰减的事件（<2秒）则对应于SCG的胞吐。分析显示，大部分（~70%）的融合事件来自MCG，仅有少量（~4%）来自MVB，表明MCG是免疫突触处极化外泌体释放的主要来源。
3.3 MCG释放的外泌体呈现四跨膜蛋白表达异质性
TIRFM分析CD63和CD81的共释放动力学显示，大多数MCG融合事件（71.4%）中，CD63和CD81信号均呈现长衰减，表明外泌体同时含有这两种蛋白。然而，超过70%的此类事件中，CD63的衰减时间显著长于CD81。另有17.1%的事件仅CD63呈长衰减，而CD81呈短衰减。这些结果提示，在MCG中，CD81更多地与细胞器膜相关，而CD63则高度富集于外泌体膜上。
3.4 CD81是MVB和MCG膜的特异性标记
通过对分离的MVB、MCG和SCG进行表面染色和SIM分析，发现CD81在MVB（79.1%）和MCG（73.2%）膜上的丰度显著高于SCG（31.9%）。相反，CD63在SCG膜（64.5%）的丰度高于MVB（14.4%）和MCG（15.5%）。这进一步证实了CD81和CD63在CTL不同细胞器膜上的差异分布。
3.5 分离的T细胞来源外泌体显示基于尺寸的两个亚群
透射电镜（TEM）分析显示，从CTL培养上清分离的外泌体存在30-80 nm和80-150 nm两个尺寸群体。蛋白质组学鉴定出824个蛋白质，其中79个属于外泌体数据库（Exocarta）Top 100蛋白，且未检测到内质网标记物钙联接蛋白，证实了分离产物的高纯度。蛋白质功能分类显示，外泌体含有囊泡运输、免疫信号、应激反应（如HSP70）、代谢以及凋亡通路（如STAT1、Caspase-3、BAX）相关蛋白。
3.6 四跨膜蛋白CD63和CD81定位于不同的外泌体亚群
对分离的外泌体进行CD63和CD81共染色及SIM分析，发现两者共定位程度极低（Pearson系数~0.041），表明它们标记了不同的外泌体亚群。通过10倍膨胀显微镜（ONE显微镜）进一步确认，CD81和CD63分别标记完全独立的外泌体群体，且CD81主要与较小的外泌体（30-80 nm）相关，而CD63与较大的外泌体（80-150 nm）相关。
3.7 CD63阳性外泌体富含凋亡相关蛋白
对CD63+和CD81+外泌体进行差异蛋白质组学分析，共鉴定3627个蛋白质。主成分分析（PCA）和相关性热图均显示两组样本明显分离。火山图分析发现，297个蛋白在CD63+样本中显著富集，309个在CD81+样本中富集。值得注意的是，CD63+外泌体中富含大量促凋亡蛋白（如Naip6, Naip7, Slit2等）。基因本体（GO）分析也显示，CD63+外泌体在分子功能上富集了多种肽酶及其调节活性，提示其在凋亡中可能发挥更重要的作用。
3.8 Munc13-4 KO CTLs分泌与WT形态和四跨膜蛋白谱相似的外泌体
电子显微镜分析显示，Munc13-4 KO CTLs在形成长时间免疫突触后，其SCG和MCG在突触区域显著积聚，但细胞器直径与WT无差异，表明Munc13-4缺失影响胞吐而非细胞器成熟。从培养上清分离的外泌体在尺寸上无差异，但Munc13-4 KO CTLs的外泌体产量减少了约18%。免疫染色分析显示，与WT相比，Munc13-4 KO来源外泌体中CD63+亚群比例显著降低约13%，而CD81+亚群比例相应增加。TIRFM实验证实Munc13-4 KO CTLs在观察时间内无MCG融合事件。这些结果综合表明，MCG来源的（富含CD63的）外泌体在免疫突触处以Munc13-4依赖性方式极化释放，而MVB来源的（富含CD81的）外泌体则以Munc13-4非依赖性方式在突触外非极化释放。
3.9 以Munc13-4依赖性方式释放的极化外泌体通过caspase-3通路支持靶细胞杀伤
将WT和Munc13-4 KO CTLs来源的外泌体与P815肿瘤细胞共孵育。流式细胞术分析显示，孵育12小时后，WT外泌体处理组中caspase-3激活的P815细胞比例（33.1%）显著高于Munc13-4 KO外泌体处理组（15.5%）。孵育24小时后，WT组的促凋亡效果进一步增强（57.0% vs KO组 ~28.5%），且WT组的效果始终约为KO组的两倍。而两组在晚期凋亡（caspase-3和PI双阳性）细胞比例上无差异。这些功能数据直接证明，MCG来源的（即Munc13-4依赖性释放的）外泌体亚群具有更强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，其机制依赖于caspase-3的激活。
4 结论
本研究首次系统阐明了CTL来源外泌体的双重起源（MVB和MCG）、高度异质性（特别是在四跨膜蛋白组成和尺寸上）以及显著的功能差异。MCG来源的外泌体在免疫突触处以Munc13-4依赖性、极化方式释放，富含CD63和促凋亡蛋白，对肿瘤细胞具有强大的caspase-3依赖性杀伤活性。而MVB来源的外泌体则以Munc13-4非依赖性、非极化方式释放，富含CD81。该研究不仅深化了对CTL免疫应答机制的理解，揭示了外泌体作为新型效应分子的重要作用，也为基于特定亚群外泌体（特别是MCG来源的CD63+外泌体）开发更精准、高效的抗肿瘤免疫疗法提供了坚实的理论和实验基础。
