《Journal of Extracellular Vesicles》：Lipid Metabolism-Driven CNS Repair via Targeted EV Delivery of PAF to Neurons
编辑推荐：
这项研究报道了一种创新的工程化细胞外囊泡（EVs）递送策略，用于稳定并靶向递送神经再生治疗分子血小板激活因子（PAF）至受损海马。研究表明，源自EP4拮抗剂预处理的间充质干细胞（MSC）的GWEVs富含PAF，能有效恢复神经元结构、改善认知功能。其修复机制并非依赖经典的PAF受体（PTAFR），而是通过神经元PAF乙酰水解酶（PAFAH，尤其是PAFAH1B1亚基）的代谢途径，调控神经元骨架重塑。研究同时开发了生物正交点击化学标记平台，实现了GWEVs的体内实时SPECT成像，证实了其向损伤部位的靶向聚集性。该工作为治疗神经退行性疾病和创伤性脑损伤提供了一种新型的、基于脂质代谢的修复平台和潜在疗法。
1 引言
间充质干细胞（MSCs）衍生的细胞外囊泡（EVs）作为一种具有前景的无细胞再生医学工具，其临床转化面临产量低、货物组成不均一、组织靶向效率低以及缺乏明确的疗效标志物等挑战。刺激预处理MSCs可影响其功能表型和分泌组，从而增强EV的生物发生、货物富集和治疗效力。其中，抑制前列腺素E2（PGE2）信号通路，特别是通过EP4受体拮抗剂，是一种有前景的再生策略。本研究采用选择性EP4受体拮抗剂GW627368X预处理MSCs，发现该处理不仅能增加EV（称为GWEVs）的产量，还能富集具有生物活性的脂质分子，尤其是血小板激活因子（PAF）。PAF是一种具有神经发育和免疫调节双重作用的磷脂信号分子，但其外周快速降解和全身性促炎作用限制了其治疗应用。为克服这些障碍，本研究旨在评估GWEVs作为一种稳定、靶向的PAF递送系统，用于修复海马损伤，并探究其作用的分子机制。
2 结果
2.1 EP4拮抗剂增强MSC衍生的EV分泌并选择性富集PAF含量
研究发现，EP4受体拮抗剂处理能显著增加EV的分泌数量和总蛋白产量。蛋白质组分析显示，GWEVs中富集了与组织修复和免疫调节相关的蛋白，如CD44、CD24和CNPase。代谢组学分析进一步揭示，GWEVs中PAF的含量比未经处理的MSC-EVs高出约5倍，表明EP4拮抗能特异性富集这一关键的生物活性脂质。
2.2 PAF促进海马CA1锥体神经元的恢复
在利用Camk2a-tTA/tetO-DTA双转基因小鼠建立的可诱导、CA1特异性神经元消融模型中，发现海马损伤后，PBS处理的损伤对照组（DC）小鼠CA1区神经元数量显著减少。而通过心内注射给予PAF治疗后，CA1区神经元数量得到显著恢复，达到未损伤对照组（UC）水平的约55%。这初步证明了PAF具有促进海马神经元再生的能力。
2.3 PAF增强受损海马中的神经突发生和细胞骨架重塑
进一步研究其机制发现，PAF治疗并未显著增加损伤后海马CA1区神经干细胞标记物SOX2阳性的细胞数量，表明其作用并非促进干细胞扩增。然而，PAF处理显著恢复了CA1区神经元树突标记物微管相关蛋白2（MAP2）和轴突标记物β3-微管蛋白（β3TUB）的表达，即使在损伤后30天仍能维持，表明PAF能促进微管稳定和长期神经突生长，支持神经元的结构重塑。
2.4 PAF促进齿状回（DG）祖细胞的结构成熟
在成年大脑的神经发生主要区域——海马齿状回（DG），PAF处理促进了双皮质素（DCX）阳性祖细胞向未成熟神经元的分化，并增加了这些细胞向分子层延伸的神经突。同时，PAF处理减少了DG中未分化的SOX2阳性神经干细胞数量，并恢复了NeuN阳性成熟神经元的数量。这些结果表明，PAF能驱动损伤后DG中祖细胞的结构成熟和功能神经元补充。
2.5 PAF的神经元再生和神经突发生作用需要PAFAH的代谢加工
为探究PAF的作用机制，研究比较了天然PAF与其抗水解类似物甲基氨甲酰PAF（MPAF）。体内实验显示，PAF能有效恢复CA1神经元数量、神经元层厚度以及MAP2和β3TUB的表达，并抑制星形胶质细胞增生（GFAP阳性）和小胶质细胞活化（Iba1阳性）。而MPAF则无法产生这些有益效果。这表明PAF的治疗活性并不依赖于经典的PTAFR受体激活，而是需要PAF乙酰水解酶（PAFAH）的酶促加工。
2.6 PAF通过PAFAH依赖性加工恢复认知功能
行为学测试（新物体识别测试NORT、新位置识别测试NLRT和莫里斯水迷宫MWM）证实，海马损伤导致小鼠的识别记忆和空间学习能力受损。PAF治疗能显著恢复这些认知功能，而MPAF则无此效果。这进一步支持了PAF的神经保护作用依赖于其在脑内的酶促代谢。
2.7 PAF的治疗效果依赖于脑内局部PAFAH和中枢神经系统（CNS）的可及性
组织表达谱分析显示，PAFAH的各个亚基（PAFAH1B1， PAFAH1B2， PAFAH1B3）在脑中表达最高，而PAF受体PTAFR在脑中表达很低，主要在脾脏高表达。这提示PAF在CNS中的作用可能主要通过神经元PAFAH代谢介导。给药途径比较发现，心内注射（IC）能比静脉注射（IV）更有效地将PAF递送至脑部并恢复认知功能，强调了有效脑部递送对于发挥PAF治疗效果的重要性。
2.8 神经元PAFAH介导PAF的神经突发生效应
体外实验表明，PAF能以剂量依赖的方式促进原代海马神经元神经突生长。这种作用可被PAF的结构类似物2-硫代PAF（同样可被PAFAH水解）模拟，但无法被抗水解的MPAF或PAF的代谢产物溶血PAF（Lyso-PAF）模拟。此外，PAFAH抑制剂（MAFP或P1165）能阻断PAF的神经突发生作用。这些结果表明，PAF的神经突发生活性严格依赖于PAFAH的酶促加工过程。
2.9 PAF通过PAFAH-微管蛋白相互作用增强神经元细胞骨架重塑
在神经干细胞系NE-4C中，PAF（而非MPAF）处理能上调β3-微管蛋白和高分子量MAP2（MAP2A/B）的表达。免疫共沉淀实验进一步证明，PAF处理增强了内源性PAFAH1B1与微管相关蛋白DCX和低分子量MAP2（MAP2C/D）之间的相互作用。这表明PAF可能通过促进PAFAH1B1与细胞骨架蛋白的结合，来稳定微管并驱动神经突生长。
2.10 富含PAF的GWEVs直接促进发育中海马神经元的神经突发生
由于PAF在循环中半衰期极短（约30秒），且全身给药可能通过PTAFR引发外周炎症，因此需要一种稳定的靶向递送系统。研究表明，GWEVs能直接作用于原代海马神经元，剂量依赖性地促进其神经突生长和分支复杂性。当利用电穿孔技术将PAF中和抗体载入GWEVs（GWEV-αPAF）后，其促神经突发生的作用被消除。同样，PAFAH抑制剂也能削弱GWEVs的作用。这证实了GWEVs的神经再生活性很大程度上由其PAF货物通过PAFAH代谢途径介导。
2.11 用于追踪GWEVs的生物正交标记策略的开发与验证
为实现GWEVs的体内示踪，研究开发了一种基于应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）点击化学的生物正交标记策略。该方法通过将BCN-NC共价连接到EV表面暴露的赖氨酸上，再与叠氮-罗丹明反应，生成荧光标记的GWEV-Rho。与传统膜染料Di-8-ANEPPS（GWEV-Di-8）非共价标记相比，SPAAC标记效率更高，且能更好地保留GWEVs的生物活性（即促神经突发生能力）。
2.12 GWEVs在体靶向递送至受损海马并促进神经修复
利用SPAAC策略标记GWEVs并进行单光子发射计算机断层扫描（SPECT）成像，发现经心内注射后，放射性标记的GWEVs优先在受损海马区域积累，证实了其靶向性。在体内损伤模型中，GWEVs治疗能有效恢复CA1神经元数量、改善神经突标记物表达、抑制神经胶质增生，并挽救空间记忆缺陷。其疗效与游离PAF相当，且优于未富集PAF的普通EVs。
3 讨论与结论
本研究阐明了一种先前未被认识的、由细胞外囊泡递送的脂质代谢依赖性中枢神经系统修复机制。通过EP4拮抗预处理MSCs产生的GWEVs，能够富集并稳定递送PAF至受损脑区。GWEVs中的PAF不依赖于其经典受体PTAFR，而是通过神经元内PAFAH（尤其是PAFAH1B1亚基）的代谢，促进与微管相关蛋白（如DCX和MAP2）的相互作用，从而驱动神经元细胞骨架重塑、神经突发生和功能恢复。该策略避免了PAF全身给药的稳定性和炎症副作用问题。研究同时开发了一种功能兼容的生物正交标记平台，实现了治疗性EVs的实时体内成像与示踪。这些发现不仅定义了PAF通过PAFAH代谢发挥神经修复作用的新机制，而且展示了工程化EVs作为递送不稳定脂质疗法至中枢神经系统的可行性和应用前景，为神经退行性疾病和创伤性脑损伤的再生治疗提供了新的平台和策略。
