《Journal of Extracellular Vesicles》：Human Endometriotic Lesion-Derived Small Extracellular Vesicles Impair Macrophage Function in the Peritoneal Microenvironment
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本研究首次利用子宫内膜上皮类器官（Endometrial Epithelial Organoid, EEO）模型，深入表征了子宫内膜异位症（EM）中子宫内膜上皮细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs），揭示了其在腹膜微环境中的免疫调节功能。研究发现，相较于在位内膜，异位病灶（ECT）来源的sEVs表面标志物CD44、CD29表达上调，而EpCAM下调，并富含CD133/1和EpCAM。这些特异性标志物同样在EM患者腹腔液（PF）sEVs中高表达，表明其是PF-sEVs的重要来源。功能上，ECT EEO-sEVs和EM患者PF-sEVs能通过CD47/SIRP-α信号通路显著抑制巨噬细胞的吞噬活性。该研究为理解EM的发病机制提供了新视角，并提示sEVs可能成为潜在的治疗靶点。
1 引言
子宫内膜异位症（Endometriosis, EM）是一种慢性炎症性疾病，影响着约10%的育龄女性，其特征是子宫内膜样组织在子宫腔外（主要是盆腔）的异位生长。EM的诊断平均需要7-9年，且现有治疗方法难以根治，复发率高，导致巨大的社会经济负担。Sampson的经血逆流理论是解释异位组织存在的最广泛接受的理论，但逆流经血在大多数女性中生理性存在，因此EM的发生被认为涉及激素、免疫和遗传等多因素复杂的相互作用。
腹膜微环境在EM中至关重要，其特点是免疫细胞组成和功能改变，包括巨噬细胞募集增加、吞噬活性受损、自然杀伤细胞细胞毒性降低以及促炎/抗炎细胞因子失衡。这些免疫改变被认为有助于异位内膜组织的存活、生长及EM相关疼痛的发展。近年来，细胞外囊泡在细胞间通讯和疾病发病机制中的作用受到广泛关注。其中，小细胞外囊泡是多种生理和病理过程中的关键参与者。在EM研究中，对间质细胞来源sEVs的关注较多，但关于上皮细胞来源sEVs的作用知之甚少。然而，子宫内膜上皮细胞携带的癌基因突变多于间质细胞，且在调节局部免疫环境（特别是针对巨噬细胞）中起着关键作用。
目前，只有一项主要研究专门调查了上皮细胞来源的囊泡。此外，尽管已有研究表征了EM患者腹腔液sEVs中改变的miRNA谱，但其表面表位，特别是异位子宫内膜上皮细胞来源sEVs的表面表位仍未得到充分探索。表面蛋白可以直接调节受体细胞活性，并且通常是sEVs细胞来源的标志物，反映了周围微环境的复杂性。本研究旨在建立3D子宫内膜上皮类器官模型，以研究异位和在位内膜上皮细胞来源sEVs的标志物表达谱，并探索它们在腹膜微环境中的异质性和细胞来源，最后检验它们在调节巨噬细胞吞噬活性中的作用。
2 结果
2.1 子宫内膜上皮类器官是子宫内膜异位症细胞外囊泡研究的可靠模型
研究成功建立了三种类型的子宫内膜上皮类器官：来源于EM患者腹膜病灶的异位EEO、来源于EM患者子宫在位内膜的在位EEO，以及来源于无EM女性（对照）子宫在位内膜的在位EEO。所有三种EEO类型均表达上皮标志物pan-cytokeratin、E-cadherin和EpCAM，确认了其上皮来源。从EEO中成功分离出sEVs，其大小、浓度、标志物（CD9、CD63、CD81、Syntenin）表达及形态均符合sEVs特征，并且在不同的收集时间点和传代次数（P3-P5）中保持稳定，表明EEO模型适用于EVs的稳定生产研究。
2.2 异位于宫内膜上皮sEVs表现出病灶特异性的表面标志物谱
通过对EEO来源sEVs进行37种表面蛋白的多重流式分析，发现CD133/1和EpCAM是EEO-sEVs上最丰富的标志物。主成分分析和差异表达分析显示，与在位EEO（无论来自EM患者还是对照）相比，异位EEO来源的sEVs表面标志物CD44和CD29表达显著上调，而EpCAM和CD41b表达显著下调。这些变化可能反映了异位病灶在腹膜微环境中为适应、存活和生长所进行的调整，涉及粘附、血管生成、免疫调节和细胞表型等方面的改变。
2.3 子宫内膜上皮来源的sEVs在腹膜微环境中含量丰富
对从EM患者和对照者腹腔液中分离的sEVs进行分析，发现其同样高表达CD133/1和EpCAM，且两者表达高度相关，这表明腹腔液sEVs的一个重要来源是子宫内膜上皮细胞。此外，腹腔液sEVs还含有淋巴细胞和内皮细胞来源的标志物，反映了腹膜腔中sEVs的异质性。主成分分析显示，晚期（III/IV期）EM患者的腹腔液sEVs表面标志物谱与早期（I/II期）患者和对照者存在显著差异，其特征是免疫标志物（如CD40、CD8、HLA-DRDPDQ）表达相对较高，而干细胞/内皮标志物（如CD133/1、SSEA-4）表达较低。这与从腹腔巨噬细胞分离的sEVs的免疫富集型谱形成对比和互补。
2.4 异位于宫内膜上皮sEVs和腹腔液sEVs抑制巨噬细胞吞噬作用
功能实验发现，用异位EEO来源的sEVs或EM患者（特别是晚期）腹腔液来源的sEVs预处理巨噬细胞24小时，可显著抑制巨噬细胞对pHrodo标记的大肠杆菌生物颗粒的吞噬活性。这种抑制作用在去除sEVs的EEO条件培养基或腹腔液中不复存在，证实了抑制作用由sEVs介导。进一步机制探索表明，sEVs表面的免疫检查点蛋白CD47可能参与了这一抑制过程。在腹腔液sEVs上检测到CD47与CD133/1和EpCAM的共表达，提示子宫内膜上皮来源的sEVs可能通过CD47/SIRP-α信号通路介导对巨噬细胞吞噬作用的抑制。使用CD47阻断抗体可以逆转异位EEO-sEVs和EM患者腹腔液sEVs对巨噬细胞吞噬的抑制作用，直接证明了CD47/SIRP-α通路的关键角色。
3 讨论与结论
本研究首次利用EEO模型系统地表征了EM中子宫内膜上皮细胞来源sEVs的表面蛋白组，并揭示了它们在腹膜免疫微环境中的重要功能。研究发现，异位病灶来源的上皮sEVs具有独特的表面标志物“指纹”（CD44highCD29highEpCAMlow），这些sEVs进入腹腔液，构成了EM特异性sEVs特征的重要组成部分。这些sEVs能够通过其表面的CD47与巨噬细胞上的SIRP-α受体结合，传递“别吃我”信号，从而抑制巨噬细胞的吞噬功能。这为EM病灶在免疫监视下得以生存和生长提供了新的机制解释：病灶释放的sEVs像“特洛伊木马”一样，直接“关闭”了巨噬细胞这一重要免疫守卫的清除能力。
这项研究不仅增进了对EM发病机制的理解，揭示了sEVs介导的细胞间通讯在塑造免疫抑制性腹膜微环境中的关键作用，也为开发新的诊断标志物和治疗策略提供了思路。例如，靶向CD47/SIRP-α轴或病灶特异性sEVs，可能成为未来治疗EM的新方向。
