基于网络药理学和SIRTs/FOXO3a级联的邻氨基苯甲酸磺胺类药物阿尔茨海默病治疗新策略

《Journal of Neurochemistry》：Unraveling Network Pharmacology-Based Therapeutics of Anthranilate Sulfonamides via Sirtuins/FOXO3a Cascade in Alzheimer's Disease

本文深入探讨了邻氨基苯-磺胺类化合物(SA1–4)通过靶向NAD+依赖的去乙酰化酶SIRT1/SIRT2/SIRT3，进而调控FOXO3a长寿信号通路、抗氧化酶(SOD2和CAT)、凋亡蛋白(BAX/BCL-2)及线粒体功能，最终在H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤模型中展现出显著的神经保护作用。结合分子对接、网络药理学及ADMET性质预测，该研究揭示了这类化合物作为多靶点抗阿尔茨海默病(AD)候选药物的巨大潜力，为神经退行性疾病及抗衰老治疗提供了新思路。

　　

研究背景与目标

随着全球人口老龄化加剧，神经退行性疾病(NDs)的负担日益加重，寻找有效的疾病修饰药物迫在眉睫。磺胺类药物作为一种经典的药效团，具有广泛的生物活性。本研究聚焦于一组环境友好型合成的邻氨基苯甲酸磺胺类化合物(SA^1–4)，旨在探究其在氧化应激模型中的神经保护作用及潜在分子机制。

研究方法

研究采用多学科交叉方法，包括体外细胞实验、计算机模拟和网络药理学分析。

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  细胞模型：使用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，建立H₂O₂诱导的氧化损伤模型。
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  细胞活力与凋亡检测：通过MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法、Annexin V/7-AAD双染流式细胞术评估细胞存活和凋亡情况。
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  氧化应激与线粒体功能指标：利用DCFDA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平，通过罗丹明123染色评估线粒体膜电位(MMP)。
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  蛋白表达分析：采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测SIRT1/2/3、FOXO3a、SOD2、CAT、BAX、BCL-2等关键蛋白的表达。
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  SIRT1酶活性与免疫荧光：通过商业化荧光法检测细胞和细胞裂解液中SIRT1的脱乙酰酶活性，并通过免疫荧光染色观察SIRT1在细胞内的定位。
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  分子对接模拟：使用AutoDock软件，以SIRT1蛋白晶体结构(PDB ID: 5BTR)为靶点，探究SA^1–4及原型AA与SIRT1活性位点的结合模式。
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  ADMET性质预测：利用SwissADME、pkCSM、ADMETLab 2.0等在线工具预测化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性特性。
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  网络药理学分析：通过SwissTargetPrediction、SuperPRED、SEA等数据库预测化合物靶点，与DisGeNET和GeneCards数据库中的NDs靶点取交集，利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络，并通过Cytoscape进行可视化分析，进行GO功能和KEGG通路富集。

主要结果

1. 1.
   化合物SA1–4在低浓度下对神经细胞无毒，并能有效抵抗氧化损伤
   MTT实验表明，在1 μM浓度下，化合物SA^1–4及其原型AA对SH-SY5Y细胞均无显著毒性。当用400 μM H₂O₂诱导细胞氧化损伤时，预先用1 μM的SA^1–4或AA处理3小时，能显著提高细胞存活率，形态学观察也显示它们能减少H₂O₂引起的细胞皱缩、短突起等凋亡样形态改变。
2. 2.
   SA1–4展现出强大的抗氧化、抗凋亡及线粒体保护作用
   流式细胞术结果显示，SA^1–4能显著减少H₂O₂诱导的早期凋亡和总凋亡细胞比例。LDH释放实验和DCFDA荧光检测进一步证实，SA^1–4能有效抑制H₂O₂引起的细胞毒性及ROS过量产生。同时，罗丹明123染色表明，SA^1–4能显著恢复因H₂O₂而降低的线粒体膜电位，显示出对线粒体功能的保护作用。
3. 3.
   SA1–4通过激活SIRTs/FOXO3a长寿信号通路发挥神经保护作用
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     激活SIRT1酶活性与蛋白表达：在细胞水平和无细胞体系中，SA¹，特别是SA¹，能显著激活SIRT1脱乙酰酶活性。Western Blot结果显示，SA¹、SA²和SA⁴能上调H₂O₂处理细胞中被抑制的SIRT1蛋白表达。免疫荧光实验也证实，SA¹和SA²能恢复H₂O₂损伤下细胞内SIRT1的核定位。
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     调节SIRT2、SIRT3及下游FOXO3a：研究发现，H₂O₂会上调SIRT2、下调SIRT3的蛋白表达，而SA^1–4能将这些异常表达恢复至接近正常水平。同时，作为SIRTs下游关键转录因子，FOXO3a的蛋白表达在H₂O₂损伤下被抑制，而SA^1–4能有效逆转这一抑制。
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     调控抗氧化与凋亡相关蛋白：SA¹和SA²能显著上调因H₂O₂而降低的内源性抗氧化酶SOD2和CAT的表达。此外，所有SA^1–4化合物均能下调促凋亡蛋白BAX，并上调抗凋亡蛋白BCL-2的表达，从而抑制细胞凋亡。
4. 4.
   分子对接揭示SA1–4与SIRT1活性位点的强结合能力
   分子对接模拟显示，所有SA^1–4化合物都能很好地结合在SIRT1蛋白(PDB: 5BTR)的活性位点，其结合自由能(-8.26 至 -8.54 kcal/mol)优于原型AA(-4.86 kcal/mol)，甚至优于已知的SIRT1激活剂白藜芦醇(RSV, -7.57 kcal/mol)。它们主要通过π-π相互作用与ILE223和ARG446结合，并通过磺酰胺或羧基上的氧原子与ASN226形成氢键，这种额外的氢键可能是其结合力更强的原因之一。
5. 5.
   网络药理学预测SA1–4的多靶点治疗潜力及相关通路
   通过整合分析，共筛选出38个化合物与NDs的共同靶点。PPI网络和拓扑分析确定了20个核心靶点，包括STAT3、NFKB1、PIK3R1、SIRT1、ADAM10、CDK5等。GO和KEGG通路富集分析表明，这些靶点与“阿尔茨海默病”、“癌症通路”、“HIF-1信号通路”等密切相关。具体到阿尔茨海默病通路，SA^1–4可能通过调节多个关键节点发挥作用：
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     非淀粉样蛋白生成途径中的ADAM10。
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     Tau蛋白磷酸化过程中的CDK5。
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     钙稳态相关的CAPN1。
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     胰岛素介导的葡萄糖摄取相关的PI3K。
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     晚期糖基化终末产物(AGEs)-RAGE轴下游的NFKB、iNOS和COX2。
     这些发现从系统层面支持了SA^1–4通过多靶点、多通路发挥抗AD作用的潜力。
6. 6.
   ADMET预测显示良好的成药性前景
   基于Lipinski五规则、Veber规则和Ghose规则的计算分析显示，SA^1–4均具有良好的类药性，没有违规项。ADMET预测表明，这些化合物具有中高水溶性、高肠道吸收和高皮肤渗透性，且能有效穿透血脑屏障(BBB)和进入中枢神经系统(CNS)。它们不被主要的细胞色素P450酶(CYP2D6, CYP3A4)代谢，也不是其主要抑制剂，预示较低的药物-药物相互作用风险。毒性预测显示，它们无AMES致癌性，且大多数无肝毒性。综合来看，SA^1–4具有良好的口服生物利用度潜力和安全性。

结论与展望

本研究系统阐明了四种邻氨基苯甲酸磺胺类化合物(SA^1–4)在抵抗氧化损伤诱导的神经细胞凋亡方面的显著效果。其核心机制是通过模拟白藜芦醇(RSV)与SIRT1结合，激活SIRT1/2/3-FOXO3a信号轴，进而增强内源性抗氧化防御(SOD2, CAT)、抑制线粒体功能障碍、平衡促凋亡(BAX)与抗凋亡(BCL-2)蛋白，从而发挥神经保护作用。分子对接证实其与SIRT1的结合能力优于原型AA。网络药理学分析进一步揭示了其在调节非淀粉样蛋白生成、Tau磷酸化、钙稳态、胰岛素信号及神经炎症等多条AD相关通路中的潜在价值。同时，ADMET预测支持了其良好的成药性。因此，SA^1–4作为新型SIRT1激活剂，展现出了作为多靶点抗阿尔茨海默病候选药物的巨大潜力。未来的研究需推进至体内模型和临床试验，以验证其疗效和安全性，为开发新一代神经退行性疾病治疗药物铺平道路。