含有L-叔亮氨酸的合成大麻素受体激动剂的高效激动作用评估

《Neuropharmacology》：Assessment of high-efficacy agonism in synthetic cannabinoid receptor agonists containing l- tert-leucinate

合成大麻素受体激动剂（SCRAs）的结构-活性关系研究，通过比较头部（l-亮氨酸/tert-亮氨酸）、核心（吲哚/吲唑）和尾部（5-氟戊基/4-氟苯基）八种化合物的BRET实验，发现l-tert-亮氨酸头部和吲唑核心可产生超激活效应，并验证跨膜区2（TM2）F170、F174、F177、H178与头部基团的关键互作，体外切片电生理学证实其高效能响应。

　　

克里斯托弗·卢卡伊（Christopher Lucaj）| 苏贞儿（Soo Jung Oh）| 夏洛特·皮塔（Charlotte Pitha）| 乔丹·戴维斯（Jordan Davis）| 史磊（Lei Shi）| 依野英明（Hideaki Yano）

美国马萨诸塞州波士顿东北大学（Northeastern University）布维健康科学学院（Bouvé College of Health Sciences）药学与药学科学系（School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences），药物发现中心（Center for Drug Discovery），邮编02115

摘要

合成大麻素受体激动剂（Synthetic Cannabinoid Receptor Agonists, SCRAs）是一类新的精神活性物质，由于其广泛的严重不良反应而带来巨大的健康风险。最新研究表明，某些具有特定结构部分的SCRAs具有超激动作用（superagonism），但这一现象仍不甚明了。本文通过不同的生物发光共振能量转移（BRET）实验方法，比较了八种化合物的结构-活性关系（Structure-Activity Relationships, SARs），这些化合物在头部结构（L-缬氨酸与L-叔-亮氨酸）、核心结构（吲哚与吲唑）和尾部结构（5-氟戊基与4-氟苄基）上存在差异。研究发现，L-叔-亮氨酸头部结构和吲唑核心结构能够在多种Gα_i/o蛋白及β-阿瑞斯汀-2（β-arrestin-2）中引发超激动作用。在构建了大麻素1型受体（CB1R）突变体后，我们发现SCRAs的头部结构在F170、F174、F177和H178位点的跨膜相互作用对于激活受体至关重要。最后，实验发现L-叔-亮氨酸类SCRAs在体外切片电生理学实验中表现出高效的作用。

引言

SCRAs使用后出现的严重不良反应与大麻素Δ9-四氢大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol, THC）的不良反应不同，后者是大麻（Cannabis sativa）中的活性成分。SCRAs的氨基烷基杂环骨架允许进行迭代设计，从而显著提高其效力和毒性。因此，自2013年以来，SCRAs被联合国毒品和犯罪问题办公室（United Nations Office on Drugs and Crime）列为每年新发现的精神活性物质（New Psychoactive Substances, NPS）中最为常见的类型之一[5]。其中一种SCRAs——MMB-FUBINACA，在2016年导致了一起广为人知的药物中毒事件，当时33名使用者出现了类似僵尸的僵直行为[6]。在另一例临床案例中，患者在使用另一种SCRAs ADB-PINACA后出现了极度兴奋、攻击性和癫痫发作[3]。与长期使用大麻相比，停止使用SCRAs可能导致更严重的戒断症状，尽管发生频率和剂量较低[7, 8]。虽然罕见，但已有报道指出SCRAs过量使用可能导致致命后果，而大麻使用则未出现这种情况[9, 10, 11, 12]。

SCRAs具有高亲和力，能够结合大脑和中枢神经系统（CNS）中高度表达的G蛋白偶联受体（G-Protein-Coupled Receptors, GPCRs）CB1R[1, 13]。CB1R通过Gα_i/o信号通路调控神经递质的释放，该通路由突触末端的逆向信号传导触发[14, 15]。G蛋白激活后，电压门控Ca²⁺通道被抑制，同时G蛋白门控的内向整流K⁺通道被激活，导致突触前膜超极化[14, 16]。在周围组织中，CB1R还参与心血管功能和能量代谢[17, 18, 19]。CB1R的表达和功能依赖于Gα_i/o蛋白亚家族的差异性表达，该亚家族包括普遍存在的抑制性G蛋白（Gα_i1, Gα_i2, Gα_i3）和神经元特异性抑制性G蛋白（Gα_oA, Gα_oB, Gα_z）[20, 21, 22, 23]。药理学研究揭示了SCRAs通过CB1R介导的cAMP抑制作用以及β-阿瑞斯汀内化效应[24, 25, 26, 27]。配体介导的G蛋白选择性信号传导能够区分多巴胺D2受体（D2R-Gα_i1 vs. D2R-Gα_oA）中的神经元信号传导与腺苷A1受体（A1R-Gα_oB vs. A1R-Gα_oA）中的镇痛效应[28, 29]。结构研究表明，μ阿片受体和5-羟色胺5-HT1_A受体的信号传导差异可能与结合口袋的不同结合方式有关[30, 31]。然而，关于SCRAs在Gα_i/o蛋白亚家族中的信号传导机制的研究目前还非常有限[26, 32, 33]。尽管这些研究发现SCRAs的功能选择性较低，但尚未通过严格的邻近性分析方法对结构类似物进行全面的比较。

随着新化学结构的不断涌现，SCRAs的药理学特性主要通过传统的功能实验（如效力和活性测定）进行评估。这些化学结构由三个关键部分（头部、核心和尾部）组成，因此被归类为“高效”激动剂[6, 10, 24, 25]。然而，测量受体-转导器相互作用下游活性的实验可能受到信号放大的影响，从而导致对效力评估的偏差[34]。为此，我们需要采用更严谨的研究设计以减少信号放大的影响。最近，我们研究了两种化合物5F-MMB-PICA（M-PC）和5F-MDMB-PICA（D-PC）之间的结构-活性关系，这两种化合物在头部结构上仅相差一个甲基[35]。实验表明，含有L-叔-亮氨酸头部结构的D-PC具有超激动作用，其效力高于内源性配体；而M-PC则表现为完全激动剂[34, 35]。分子动力学模拟显示，这两种化合物与细胞外TM2结构域中的关键残基的相互作用程度不同，而该区域最近被证实对CB1R的激活至关重要[35, 36, 37, 38]。尽管我们发现某些SCRAs具有超激动作用，但对其具体机制仍需进一步研究。

在本研究中，我们进一步探讨了SCRAs不同结构部分对CB1R超激动作用的影响，重点关注头部、核心和尾部结构的变化。通过多种BRET实验方法评估了这些化合物的效力、选择性和功能特性，并对CB1R的TM2残基进行了点突变分析，以揭示其与L-叔-亮氨酸头部结构的相互作用。最后，我们通过体外切片电生理实验测量了SCRAs对海马区谷氨酸释放的抑制作用。

部分内容摘录

哺乳动物细胞培养

所有体外实验均在Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中培养的人类胚胎肾293 T（HEK-293T）细胞上进行，培养基中添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺，培养条件为37°C和5%二氧化碳（CO₂）。HEK-293T细胞以每毫升375,000个细胞（3 × 10⁶细胞/8毫升）的高密度接种在10厘米培养皿中，转染前24小时进行培养。细胞采用无菌技术维护，并用于药理学实验。

L-叔-亮氨酸头部结构赋予SCRAs高效性

在研究了L-缬氨酸和L-叔-亮氨酸（即MMB-和MDMB-）头部结构对5-氟苯基吲哚类化合物效力的显著差异后[35]，我们进一步探讨了核心结构和尾部结构与头部结构的组合效应。临床研究表明，基于吲唑的SCRAs滥用会导致严重后果，甚至死亡[3, 6, 46, 47]。此外，辉瑞公司申请的专利衍生物以及2016年布鲁克林事件中的相关药物也反映了这一问题。

讨论

先前的研究将本文使用的多种SCRAs归类为“高效”激动剂[32, 50, 51]。通过BRET实验，我们能够更准确地评估信号放大和受体储备对实验结果的影响，从而避免对效力和活性的误判[34, 52]。在本研究中，我们使用Gαi1和β-阿瑞斯汀-2作为标记效应蛋白。

结论

SCRAs的模块化结构设计产生了大量新型化合物，其中许多具有毒性。本研究探讨了TM2结构部分在SCRAs诱导的CB1R超激动作用中的作用。通过对比头部、核心和尾部结构，我们详细分析了L-叔-亮氨酸头部结构引起的超激动作用。研究发现，不同SCRAs通过不同的Gα_i/o亚型发挥超激动作用。

作者贡献声明

夏洛特·皮塔（Charlotte Pitha）： 方法学设计、实验实施。史磊（Lei Shi）： 文章撰写、审稿与编辑、资源准备。乔丹·戴维斯（Jordan Davis）： 方法学设计、实验实施。依野英明（Hideaki Yano）： 文章撰写、审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资金获取、数据分析、概念构思。苏贞儿（Soo Jung Oh）： 方法学设计、实验实施。克里斯托弗·卢卡伊（Christopher Lucaj）： 文章撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、方法学设计、实验实施、数据分析。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能构成利益冲突的财务关系/个人关联：

依野英明（Hideaki Yano）表示获得了东北大学（Northeastern University）的财务支持。其他作者声明没有可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢与资助

本研究得到了“大脑与行为研究基金会”（Brain & Behavior Research Foundation）青年研究员资助（H.Y.）以及“国家药物滥用研究所”（National Institute on Drug Abuse）的资助（T32DA055553，资助对象为C.L.）。感谢Carl Lupica博士和Alexander Hoffman博士在脑切片电生理学方面的技术指导与交流。