《Neurotherapeutics》：Intravenous miR-30c therapy confers dual neurovascular protection and improves long-term recovery after ischemic stroke
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为攻克缺血性脑卒中再灌注损伤后“微血管再阻塞”与“神经元内质网应激”两大难题，本研究通过静脉递送PEG化脂质体包裹的miR-30c模拟物，在临床治疗时间窗（3–4.5小时）内干预大脑中动脉闭塞小鼠模型。结果显示，治疗不仅显著缩小梗死体积、改善神经功能，还通过抑制内皮PAI-1减轻微血管血栓形成，同时下调神经元ER应激与线粒体凋亡通路。该研究为同时靶向血管与神经元损伤的脑卒中治疗提供了新策略。
在世界范围内，缺血性脑卒中依然是导致死亡和残疾的主要原因。尽管静脉溶栓和血管内取栓等再灌注治疗能快速恢复脑血流，挽救缺血半暗带，但许多患者即便血管成功再通，仍会因缺血/再灌注损伤而出现神经功能恶化。其中，下游微血管血栓形成和神经元内质网应激被认为是导致不良预后的关键驱动因素。微血管血栓形成会阻塞微循环血流，损害半暗带组织灌注，加剧梗死进展；而持续的内质网应激则会触发线粒体功能障碍和神经元凋亡。由于这两条通路共同加剧了血管和神经元损伤，同时靶向它们可能提供协同的神经血管保护。然而，目前能同时针对这两个过程的治疗策略仍十分有限。
在这一背景下，微小核糖核酸因其能够转录后调控基因表达，已成为缺血性脑卒中潜在的生物标志物和治疗候选分子。其中，miR-30c的表达降低与高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病等脑卒中主要危险因素相关，但其在卒中后治疗中的潜力，特别是通过全身给药途径在临床相关时间窗内给予的治疗效果，尚未得到充分探索。为此，发表在《Neurotherapeutics》上的这项研究，深入探究了静脉注射miR-30c模拟物在局灶性脑缺血/再灌注损伤小鼠模型中的治疗效果及潜在机制。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，使用经典的短暂性大脑中动脉闭塞模型模拟人类缺血性脑卒中。其次，通过PEG化脂质体包裹技术递送化学修饰的miR-30c模拟物，以增强其稳定性和脑部摄取。研究涵盖了不同年龄和性别的动物，以评估治疗的普适性。在机制探究层面，综合运用了荧光原位杂交、免疫荧光染色、Western blot、酶联免疫吸附测定及多种行为学测试等方法，从分子、细胞到整体功能水平进行全面评估。此外，还使用了特异性阻断miR-30c与PAI-1 mRNA结合的Vivo-Morpholino反义寡核苷酸，来验证靶点相互作用。
研究结果
1. miR-30c在正常脑中的表达，局灶性脑缺血后下调，以及静脉注射miR-30c模拟物治疗后上调
研究人员首先发现，在正常年轻成年雄性小鼠的皮层、纹状体和海马中，miR-30c表达丰富，且主要定位于NeuN阳性的神经元。卒中后，缺血半球的miR-30c水平在再灌注后4小时即显著下降，并持续至72小时。静脉注射PEG化脂质体包裹的miR-30c模拟物（卒中后3小时给药）能有效恢复缺血脑组织的miR-30c水平。
2. 静脉注射miR-30c模拟物对年轻和年老小鼠的卒中后神经保护作用
剂量反应研究表明，在年轻成年雄性小鼠中，卒中后3小时开始给予2.5或5.0 mg/kg剂量的miR-30c模拟物能显著减小梗死体积并改善神经功能。治疗时间窗研究显示，在卒中后4.5小时内开始治疗仍然有效，而延迟至6或9小时则无效。更重要的是，在中年（12-13个月）雄性和雌性小鼠中，相同剂量的治疗同样能显著减小梗死体积并改善多种行为学评分，表明其疗效具有跨年龄和跨性别的普适性。
3. 静脉注射miR-30c模拟物通过靶向抑制PAI-1减轻继发性微血管血栓形成
机制研究表明，卒中后缺血脑组织中纤溶酶原激活物抑制剂-1的mRNA和蛋白水平显著升高，而miR-30c治疗能显著抑制这一升高。免疫荧光显示，PAI-1的上调主要定位于脑内皮细胞。使用特异性Vivo-Morpholino阻断miR-30c与PAI-1 mRNA的3'非翻译区结合后，miR-30c对内皮PAI-1的抑制作用及其带来的益处被完全逆转。进一步地，miR-30c治疗显著减少了微血管内的纤维蛋白/纤维蛋白原和血小板沉积，并改善了脑微血管的通畅性。这些结果首次提供了体内证据，表明内皮PAI-1的上调是缺血性脑卒中后继发性微血管血栓形成的关键介质，而miR-30c通过靶向抑制内皮PAI-1来减轻这一过程。
4. 静脉注射miR-30c模拟物通过抑制内质网应激和线粒体凋亡通路减轻神经元损伤
研究发现，卒中后皮层和海马神经元中内质网应激标志物（磷酸化eIF2α、ATF4、CHOP）显著增加。miR-30c治疗能有效减轻这些内质网应激反应。同时，卒中导致促凋亡蛋白Bax在线粒体中的积累增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2减少，破坏了线粒体的稳定性。miR-30c治疗恢复了线粒体Bcl-2水平，降低了线粒体Bax，从而保持了Bcl-2/Bax的平衡，抑制了线粒体凋亡通路的激活。这最终体现为Fluoro-Jade C阳性的变性神经元和TUNEL/NeuN双阳性的凋亡神经元数量显著减少。
5. 静脉注射miR-30c模拟物改善年老小鼠卒中后的长期运动和认知恢复
在中年雌性小鼠中进行的长期（35天）结局评估显示，miR-30c治疗显著改善了从第7天到第28天的运动功能（旋转杆和握力测试）。在认知方面，治疗也促进了空间学习和记忆功能（巴恩斯迷宫）以及识别记忆（新物体识别测试）的恢复。这些结果表明，miR-30c治疗不仅能提供急性神经保护，还能促进长期的神经功能修复。
研究结论与意义
本研究首次证明，在临床相关时间窗内，静脉注射miR-30c模拟物能有效减轻急性脑缺血/再灌注损伤，并促进长期功能恢复。其疗效在不同年龄和性别的动物中得到验证，增强了其转化潜力。在机制上，该研究揭示了miR-30c具有双重神经血管保护作用：一方面，通过直接抑制内皮细胞中的PAI-1，减轻继发性微血管血栓形成，改善脑组织灌注；另一方面，通过抑制神经元内质网应激及其下游的线粒体凋亡信号通路，减少神经元死亡。
这项研究的重大意义在于，它提出了一种能同时针对卒中后血管阻塞和神经元凋亡这两大核心病理过程的创新治疗策略。利用FDA已批准的PEG化脂质体递送平台，克服了microRNA疗法在稳定性、血脑屏障穿透性和靶细胞摄取方面的传统障碍。研究结果为将miR-30c基于的疗法推向缺血性脑卒中的临床转化提供了强有力的理论依据和实验支持，有望成为增强现有再灌注疗法疗效的补充策略，为众多卒中患者带来新的希望。
