《MicrobiologyOpen》：Green and Ecofriendly Mycosynthesis of Nanocomposite Based on Zinc and Magnesium Oxide Nanoparticles Using Endophytic Sarocladium kiliense: Characterization, Anticancer Activity, Antimicrobial and Antibiofilm Activities
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本研究提出了一种绿色、可持续的真菌介导纳米合成策略。利用内生真菌“Sarocladium kiliense” PV248633.1的生物催化作用，成功制备了氧化锌-氧化镁纳米复合物（ZnO-MgO NCs）。该纳米复合物展现出显著的抗癌（对MCF-7乳腺癌细胞IC50=78.1 μg/mL）、抗菌（尤其针对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌）和抗生物膜活性，且对正常细胞毒性较低，为应对抗生素耐药性和癌症治疗提供了新型、高效的候选纳米材料，具有广阔的生物医学应用潜力。
1 引言
纳米技术在材料科学领域带来了革命性突破，使得在纳米尺度上操控材料成为可能，从而开发出性能增强、功能多样的新材料。纳米粒子（NP）合成已成为创造具有特殊物理化学特性的新型材料的强大方法。金属和金属氧化物纳米粒子因其高表面积体积比和独特的表面性质，在医学、农业和环境修复等领域展现出广泛的应用前景。然而，传统的合成方法如化学还原法和物理沉积法常涉及危险试剂、高能耗并产生有毒副产物。因此，可持续或生态友好的合成方法，包括利用细菌、真菌、藻类和植物的生物合成途径，正受到越来越多的关注。
真菌因其高金属耐受性、可产生大量生物质、培养要求简单以及能分泌多样化的生物活性化合物（如蛋白质、多糖、酶和酚类物质）等优势，已成为生态友好型纳米粒子合成的理想生物工厂。这些化合物在金属离子还原以及调控纳米粒子尺寸和形态方面发挥着至关重要的作用。真菌介导的合成通常能获得比传统方法更稳定、更均匀且生物活性更强的纳米粒子。
氧化锌（ZnO）纳米粒子因其能产生活性氧、破坏细菌细胞膜和诱导癌细胞凋亡，已被证实具有良好的抗菌和抗癌效果。同样，氧化镁（MgO）纳米粒子因其抗菌功效、抗生物膜能力和生物相容性，也成为生物医学应用的有力候选者。通过协同作用，将两种金属氧化物结合形成双金属纳米粒子系统，可以改善其物理化学和生物学特性，例如增强稳定性、降低毒性、提高催化效率、抗菌效力和抗癌活性。
本研究利用丝状内生真菌“Sarocladium kiliense”（S. kiliense） PV248633.1，开展了氧化锌-氧化镁纳米复合物（ZnO-MgO NCs）的生物合成，并评估了其抗癌、抗菌和抗生物膜活性，旨在填补这一研究领域的空白。
2 材料与方法
2.1 化学品与试剂
主要使用了六水合硝酸锌和六水合硝酸镁作为金属离子前驱体，氢氧化钠作为沉淀剂。真菌培养基为查氏培养基。
2.2 ZnO-MgO NCs的绿色合成
将培养后的“S. kiliense”真菌菌饼转移至查氏液体培养基中培养，收获菌丝体并制备真菌生物质滤液。将该滤液与锌盐和镁盐混合，在特定条件下孵育，形成白色沉淀即表示ZnO-MgO NCs成功合成，随后进行收集和干燥。
2.3 ZnO-MgO NCs的表征
采用紫外-可见光谱（UV-Vis）分析其光学性质和表面等离子体共振吸收峰；傅里叶变换红外光谱（FTIR）鉴定参与合成的功能基团；透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）分析其形貌、粒径及分布；扫描电子显微镜（SEM）观察表面形貌；能量色散X射线光谱（EDX）分析元素组成；X射线衍射（XRD）分析其晶体结构和结晶度。
2.4 抗癌活性
采用MTT法评估了生物合成的ZnO-MgO NCs对人正常肺成纤维细胞（WI-38）和乳腺癌细胞（MCF-7）的细胞毒性。通过计算细胞存活率和抑制率，测定其对正常细胞和癌细胞的半数抑制浓度（IC50）。
2.5 抗菌活性
2.5.1 初步筛选
采用琼脂孔扩散法（WDA）评估了ZnO-MgO NCs对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌的抑制效果，测量抑菌圈直径并计算抑制百分比。
2.5.2 定量筛选
采用肉汤微量稀释法测定ZnO-MgO NCs对上述菌株的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），并据此判断其作用是杀菌还是抑菌。
2.5.3 生物膜抑制与清除实验
采用结晶紫染色法，分别在生物膜形成阶段（抑制实验）和生物膜成熟后（清除实验）加入不同浓度的ZnO-MgO NCs，通过测量吸光度来定量评估其对生物膜的抑制和清除能力。
2.5.4 药物协同实验
采用棋盘格微量稀释法，评估ZnO-MgO NCs与头孢吡肟联合使用时，对测试菌株的相互作用效果（协同、相加或无关），通过计算分级抑菌浓度指数（FICi）进行判断。
2.6 统计分析
所有实验均进行三次重复，数据以均值±标准差表示。采用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析（ANOVA）和图基事后检验，以p < 0.05为差异具有统计学意义。
3 结果与讨论
3.1 纳米复合物的表征
合成成功的标志是反应混合物颜色变为白色并出现沉淀。UV-Vis光谱在300 nm处出现特征吸收峰，表明形成了金属氧化物异质结。FTIR光谱在3689 cm-1（O─H伸缩）、2228 cm-1（C═C伸缩）以及400-1000 cm-1范围（金属-氧键）等处的吸收峰，证实了相关功能基团的存在和NCs的成功形成。TEM图像显示纳米粒子呈聚集簇状晶体结构，平均粒径约为35 nm。DLS分析显示其平均流体动力学直径约为45 nm，多分散指数为0.248，表明胶体溶液均匀。SEM图像显示其具有聚集的层状片状结构。EDX分析证实了Zn、Mg、O、C和N元素的存在，其中Zn和Mg的重量百分比分别为25.1%和24.6%，证明了ZnO-MgO NCs的成功制备。XRD图谱中的特征衍射峰分别与ZnO和MgO的标准卡片匹配，证实了复合材料中两相共存，且计算出的平均晶粒尺寸约为34 nm。
3.2 细胞毒性与抗癌活性
ZnO-MgO NCs对正常WI-38细胞表现出较低的细胞毒性，IC50为218.7 μg/mL，表明其具有良好的生物安全性。相反，它对MCF-7乳腺癌细胞显示出显著的抗癌活性，IC50为78.1 μg/mL。在31.25至250 μg/mL浓度范围内，其对MCF-7细胞的抗肿瘤活性呈现出明显的剂量依赖性增强。其抗癌机制可能涉及产生活性氧（ROS）、诱导DNA和蛋白质损伤、引发氧化应激和细胞凋亡，并可能选择性靶向癌细胞。
3.3 抗菌活性
3.3.1 初步活性
WDA结果显示，ZnO-MgO NCs对测试的革兰氏阴性菌均具有抗菌活性。特别值得注意的是，其对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈直径甚至超过了阳性对照头孢吡肟。而对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，头孢吡肟的活性则更强。统计分析表明，两者之间的总体差异不显著。
3.3.2 抑菌与杀菌浓度
肉汤微量稀释法测定的MIC和MBC值因菌株而异。对大肠杆菌和铜绿假单胞菌，MIC较低（64 μg/mL），但MBC较高（512 μg/mL），表现为抑菌作用。对鲍曼不动杆菌，MIC和MBC相等（128 μg/mL），表现为杀菌作用。对肺炎克雷伯菌则显示出中等活性。
3.3.3 抗生物膜效应
ZnO-MgO NCs在亚抑菌浓度下（? MIC, ? MIC, ? MIC）即能显著抑制测试菌株的生物膜形成，且效果呈浓度依赖性。其中，对铜绿假单胞菌的生物膜抑制效果最强，在? MIC时抑制率高达91.37%。
3.4 生物膜清除活性
ZnO-MgO NCs对已形成的成熟生物膜也表现出清除能力，但效果具有菌株特异性。鲍曼不动杆菌的生物膜最易被清除（清除率约80%），其次是肺炎克雷伯菌（约51%），而对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生物膜清除率相对较低（分别约21%和27%）。
3.5 协同相互作用
棋盘格实验表明，ZnO-MgO NCs与头孢吡肟联用对不同菌株的相互作用模式不同。对铜绿假单胞菌显示出协同作用（FICi=0.375），对肺炎克雷伯菌为相加作用（FICi=0.75），而对大肠杆菌和鲍曼不动杆菌则为无关作用（FICi分别为3和1.5）。
4 结论
本研究成功利用“S. kiliense” PV248633.1真菌菌株实现了ZnO-MgO NCs的绿色、环保合成。全面的表征证实了纳米复合物的成功制备及其稳定性。该材料展现出显著的抗癌活性（针对MCF-7细胞），同时对正常细胞毒性较低。在抗菌方面，它对多种革兰氏阴性菌，特别是鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，表现出强大的抑制和杀灭作用，其效果甚至在某些情况下超过了传统抗生素头孢吡肟。此外，该纳米复合物还能有效抑制和清除细菌生物膜，并与头孢吡肟产生协同或相加的抗菌效果。这些发现表明，真菌介导合成的ZnO-MgO NCs作为一种多功能纳米材料，在对抗抗生素耐药菌感染和癌症治疗方面具有巨大的应用潜力，值得进一步开展临床前和临床研究。
