《Physiological Reports》：Neurodevelopmental disorder-causing GRIN1 Y647S variant alters red blood cell physiology in mice
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该研究首次在Grin1Y647S/+转基因小鼠模型中揭示了神经发育障碍相关GRIN1基因致病变异（NMDAR功能获得性）会导致红细胞（RBC）生理的系统性改变。研究发现，该变异使小鼠RBC计数轻度增加、红细胞生成增强，并伴随NMDAR介导的钙内流（Ca2+）升高和血流条件下全血粘度降低。这些发现不仅拓展了NMDAR在非神经组织（如外周血细胞）中的生理病理角色认知，更为开发用于GRIN障碍患者分层诊断、疗效监测的外周血生物标志物提供了关键实验依据。
引言：GRIN障碍与外周血生物标志物的需求
GRIN障碍是一类由GRIN基因致病性变异引起的罕见神经发育疾病，这些基因编码N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）的GluN亚基。患者主要表现为发育迟缓、智力障碍、癫痫、自闭症、肌张力低下和视力损害等一系列神经系统症状。尽管对该病的认识逐渐加深，但目前仍缺乏有效的治疗手段以及可用于临床分层疾病严重程度或监测治疗反应的可及性生物标志物。
NMDAR在中枢神经系统的突触可塑性和脑功能中作用已被广泛研究，但它们同样在外周血细胞中表达，包括红细胞（RBCs）、白细胞和血小板。在红细胞中，NMDAR介导的钙（Ca2+）信号调控着细胞成熟、衰老、变形能力和携氧能力等多个功能方面。因此，研究人员推测，影响NMDAR的致病性变异可能改变血细胞特性，从而为生物标志物开发提供线索。
研究方法：利用转基因小鼠模型探索外周血表型
本研究采用了携带杂合Grin1 Y647S变异（Grin1Y647S/+）的转基因小鼠模型，该模型模拟了GRIN1相关神经发育障碍患者的变异。研究人员系统性地考察了多个血液学参数，旨在寻找可及的外周血生物标志物。
动物与基础血液学分析
所有动物实验均遵循加拿大动物护理委员会指南。通过隐静脉采血，使用血液分析仪对6周龄小鼠进行全血细胞计数（CBC）。结果显示，与野生型（WT）对照相比，Grin1Y647S/+小鼠的红细胞计数、血细胞比容和血红蛋白浓度均出现轻微但有统计学意义的升高。体重分析发现，8-9周龄的Grin1Y647S/+雄性和雌性小鼠体重均低于对照，而3-5月龄时，仅雄性小鼠体重显著偏低。脾脏和肝脏的相对重量基本处于正常范围。
组织学与红细胞生成分析
对脾脏、肝脏和胸骨的组织学检查显示，红髓和白髓结构正常，但普鲁士蓝染色发现，Grin1Y647S/+小鼠的骨髓和大脑中血红蛋白沉积（含铁血黄素）显著增加，而肝脏中未见明显变化，骨髓和脾脏也未发现网硬蛋白或胶原纤维化迹象。
通过光谱流式细胞术分析股骨和胫骨骨髓中的红细胞群，研究人员量化了红细胞分化阶段。与WT对照相比，Grin1Y647S/+小鼠的晚期红系前体细胞（嗜碱性、多染性和正染性成红细胞）比例以及骨髓中的红细胞数量均显著增加，而早期红系前体细胞（原红细胞）比例无差异。流式细胞术还证实了GluN1亚基（所有NMDAR的必需组分）在部分早期、晚期红系前体细胞以及红细胞表面的表达，且基因型间表达水平相似。
红细胞NMDAR功能与钙成像
为了探究Grin1Y647S/+变异对红细胞NMDAR活性的影响，研究人员测量了红细胞在NMDAR选择性激动剂NMDA（200 μM）刺激下的钙（Ca2+）内流。将红细胞固定在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，并用钙敏感染料Fluo-8 am负载后，进行活细胞荧光显微成像。
实验发现，在给予NMDA后，大约半数被测红细胞均出现钙内流，但Grin1Y647S/+红细胞的钙通量显著高于WT红细胞。预先使用竞争性NMDAR拮抗剂AP5（50 μM）处理，可完全消除钙响应，证实该钙通量主要是由NMDAR介导的。这些结果表明，Grin1Y647S/+变异增强了红细胞中NMDAR介导的钙内流，呈现出钙离子通量的功能获得性（gain-of-function）特征。
全血血液流变学分析
鉴于钙动态对红细胞变形及其后续血液流变学特性至关重要，研究人员使用平行板流变仪评估了在模拟小静脉和肌性动脉（血管直径约0.1-10 mm）流动条件下全血的粘度和剪切应力。实验采用37°C下的上升剪切速率斜坡协议。
研究发现，在红细胞变形的初始阶段（剪切速率14–120 s-1），Grin1Y647S/+小鼠的全血粘度更低，剪切应力也更小。为了确定NMDAR是否直接影响血液流变学，研究还使用了Grin1-/?敲低（KD）小鼠。有趣的是，Grin1-/?KD小鼠与其WT同窝仔鼠之间未发现显著差异。这表明，虽然Grin1Y647S/+变异能引起显著的血液流变学改变，但Grin1-/?KD并未产生明显的血液流变学变化，提示过度的NMDAR激活可能影响血液流变学，而在正常生理条件下NMDAR可能不发挥主动作用。
血红蛋白携氧功能评估
正常的血液流变学和红细胞变形能力对于氧-血红蛋白解离至关重要。研究人员使用Hemox分析仪检测了氧-血红蛋白解离曲线。结果显示，Grin1Y647S/+样本的氧-血红蛋白协同性（以描述氧平衡曲线形状的Hill系数反映）以及与血红蛋白50%饱和度对应的氧分压（P50，反映氧亲和力）均未发生改变。这表明，尽管存在非典型的血液流变学特征，但Grin1Y647S/+红细胞的基线携氧功能正常。
讨论与意义：揭示NMDAR在红细胞生理中的新角色
本研究提供了多条证据表明Grin1Y647S/+小鼠的红细胞特性发生了改变。研究发现，这些小鼠的晚期成红细胞和成熟红细胞数量增加、红细胞钙通量升高、全血粘度和剪切应力降低，并且骨髓和大脑中的含铁血黄素沉积增加。值得注意的是，尽管红细胞计数增加，但血清促红细胞生成素（EPO）浓度并无差异。骨髓流式细胞分析支持了现有证据，即NMDAR介导的钙信号参与红细胞分化。此外，研究结果还揭示了NMDAR在调节全血血液流变学中的新作用。
Grin1Y647S/+变异的功能表征一直存在挑战，不同细胞培养系统和脑内研究报道了混合效应。本研究首次在红细胞中揭示该变异导致钙内流增加，表现为功能获得性。血液流变学改变仅在功能获得性模型中出现，而在敲低模型中未出现，提示病理性的NMDAR过度激活可能影响血流特性。虽然血液流变学发生改变，但基线携氧功能未受影响，不过未来的研究需要进一步探讨NMDAR激活或抑制对氧解离的影响，以及一氧化氮-血红蛋白结合是否受影响。
最后，研究发现NMDAR功能获得性在EPO浓度正常的情况下上调了红系分化。组织学结果排除了红细胞滞留和周转异常的可能性，因此Grin1Y647S/+红细胞很可能具有正常寿命，这表明NMDAR功能获得性改变了红细胞生成过程。已知的NMDAR激活与JAK2/STAT3信号通路之间的串扰，可能解释了红系分化的轻度增加。
结论与展望
Grin1Y647S/+小鼠的血液学表型分析提供了强有力的遗传学证据，证实并拓展了此前药理学研究的发现，证明NMDAR在红细胞发育和生理中扮演着生理学角色。这项研究是首个遗传学证据，表明血液可用于直接研究GRIN1障碍中的NMDAR功能。采用相同技术检测患者血液样本，是下一步确定这些检测方法能否成为稳健的临床诊断生物标志物的关键。总之，该研究为开发用于GRIN障碍患者的外周血生物标志物开辟了新途径。
