大豆（Glycine max）黑色与黄色种皮颜色变异的转录组与代谢组整合分析：揭示黄酮生物合成的遗传与代谢调控机制及其育种应用前景

《Plant Direct》：Transcriptomic and Metabolic Insight Into Flavonoid Biosynthesis Underlying Black and Yellow Seed Coat Color Variation in Soybean (Glycine max)

本文通过整合转录组（RNA-seq）与代谢组（HPLC）分析，系统比较了大豆黑色与黄色种皮材料的黄酮类化合物积累差异及其分子调控网络。研究发现黑色种皮中总酚（TPC）、总黄酮（TFC）、总花青素（TAC）、总原花青素（TPAC）及抗氧化活性显著更高，而黄色种皮富含总异黄酮（TIC）；关键基因如F3H、ANS、UGT78D2、UGT79B6、GSTF11及R2R3-MYB转录因子在黑色种皮中上调表达，而CYP450基因在黄色种皮中优先表达。这些结果为解析大豆种皮颜色形成的分子机制提供了新见解，并为培育高营养价值的功能性大豆品种提供了候选基因靶点。

　　

1 引言

大豆（Glycine max）作为全球重要的经济作物，其种皮颜色是影响种子品质与商品价值的关键性状。种皮颜色从单色（黑、棕、黄、绿）到花纹类型多样，其中黑色种皮因富含花青素、皂苷等生物活性物质，在功能食品市场中备受青睐，而黄色种皮在商业化生产中占主导地位。种皮不仅调控种子吸水、抗病性和结构完整性，黑色与棕色种子通常表现出更强的休眠性、越冬能力和抗病性。黄酮类化合物的积累是种皮颜色的主要决定因素，但其分子机制尚不完全清楚。

2 材料与方法

研究材料为来自韩国黑种皮地方品种KWS19（母本）与黄褐色半野生型T191199（父本）杂交衍生的重组自交系（RILs）。通过单粒传法获得F₉代，筛选出黑色（2023_437B）与黄色（2023_437Y）种皮纯合株系。在播种后110天（DAS）采集种子进行RNA-seq分析，成熟种子用于代谢物测定。代谢物分析包括总酚（TPC）、总黄酮（TFC）、总花青素（TAC）、总原花青素（TPAC）、总异黄酮（TIC）含量及DPPH、ABTS抗氧化活性测定。RNA-seq数据经质控、比对至大豆参考基因组（Wm82.a4.v1），使用DESeq2进行差异表达基因（DEGs）分析（阈值|log₂FC| ≥ 2, p ≤ 0.05）。通过GO与KEGG富集分析对DEGs进行功能注释，并采用RT-qPCR验证关键基因表达。

3 结果

3.1 黑色与黄色大豆株系的表型与代谢特征

F₉黑色株系（437_B）在110 DAS开始出现明显色素沉积，至130 DAS完全变黑，而黄色株系（437_Y）保持稳定的浅黄色。代谢分析显示，黑色种皮的TPC、TFC、TAC、TPAC及抗氧化活性（DPPH、ABTS）均显著高于黄色种皮，而黄色种皮的TIC更高。相关性分析表明，TPC、TFC、TAC、TPAC与抗氧化活性呈强正相关，而TIC与TPC、TFC呈负相关。

3.2 转录组分析与差异表达基因

RNA-seq共鉴定出227个DEGs，其中110个在黑色种皮中上调，117个在黄色种皮中上调。GO富集显示，DEGs主要富集于细胞组分（膜、细胞器）、分子功能（氧化还原酶活性、转运蛋白活性）及生物过程（碳水化合物代谢、次级代谢）。KEGG富集表明，黄色种皮中嘌呤代谢、硫胺素代谢、黄酮生物合成等通路上调。

3.3 黄酮生物合成通路关键基因表达模式

黑色种皮中上调的基因包括花青素生物合成关键酶基因——黄烷酮3-羟化酶（F3H; Glyma.09G243500）和花青素合酶（ANS; Glyma.01G214200, Glyma.11G027700），以及UDP-葡萄糖基转移酶（UGT78D2, UGT79B6）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTF11）和漆酶基因（LAC5）。这些基因分别参与花青素的合成、糖基化、液泡运输及原花青素聚合。相反，白花色苷还原酶（LAR）基因在黄色种皮中表达更高。此外，R2R3-MYB转录因子（如MYB113、MYB17、MYB111同源基因）在黑色种皮中上调，而细胞色素P450基因（如CYP82A2、CYP82A4）在黄色种皮中优先表达。多个小热激蛋白（sHSPs）基因也在黑色种皮中高表达。

3.4 RT-qPCR验证

RT-qPCR结果与RNA-seq一致：F3H与ANS在黑色种皮中表达显著高于黄色种皮，而LAR在黄色种皮中表达更高。

4 讨论

4.1 种皮代谢物与抗氧化活性

黑色种皮中更高的TPC、TFC、TAC、TPAC及抗氧化活性表明其黄酮代谢流向花青素与原花青素合成，而黄色种皮则偏向异黄酮积累。花青素与原花青素是黑色种皮抗氧化能力的主要贡献者。

4.2 种皮颜色形成的候选基因

F3H与ANS的上调与黑色种皮花青素积累直接相关。LAC5在黑色种皮中的高表达可能促进原花青素聚合，而LAR的高表达并未导致黄色种皮中PA含量升高，提示存在复杂的下游调控。R2R3-MYB转录因子（如MYB113、MYB111、MYB17）可能作为花青素合成的正调节因子。CYP450基因在黄色种皮中的偏好性表达可能与异黄酮合成途径激活有关。UGT78D2与UGT79B6参与花青素的糖基化修饰，增强其稳定性；GSTF11可能介导花青素液泡转运；sHSPs的上调则暗示了应激响应与色素积累的潜在关联。

5 结论

本研究通过整合代谢组与转录组分析，揭示了大豆黑色与黄色种皮颜色变异的分子基础。黑色种皮中花青素与原花青素的高积累与F3H、ANS、UGT、GSTF11、LAC5及R2R3-MYB等基因的上调密切相关，而黄色种皮中CYP450基因的优先表达促进了异黄酮合成。这些发现为解析大豆种皮颜色形成的遗传调控网络提供了新视角，并为培育具有高抗氧化活性及特定营养品质的功能性大豆品种提供了候选基因靶点。