《Plant Physiology and Biochemistry》：Genomic analyses in castor identify signatures of selection and loci associated with hypocotyl elongation differentiation over millennia
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本研究系统揭示了蓖麻在数千年人类驯化过程中下胚轴长度分化的遗传基础与分子机制。研究人员通过整合转录组、基因组选择扫描和全基因组关联分析，定位了控制下胚轴伸长的关键基因座，并验证了HY5启动子区的一个功能变异。研究成果为解析作物驯化性状的起源提供了理论框架，并为蓖麻分子育种提供了宝贵的基因组资源。
蓖麻，作为一种能生产独特蓖麻油酸的工业油料作物，其全球传播与人类驯化的历史长达数千年。这一过程塑造了其丰富的遗传变异和表型分化，其中一个典型的性状便是下胚轴的长度。下胚轴是连接幼苗子叶和胚根的茎段，其伸长能力直接决定了种子能否成功破土而出以及幼苗的抗倒伏性，并最终影响产量。然而，长期以来，关于驯化如何影响蓖麻基因组结构的研究有限，而对于包括蓖麻在内的非模式作物，其下胚轴长度变异的根本机制仍然是个谜。为什么来自非洲野生环境的蓖麻下胚轴短，而来自中国栽培种的下胚轴长？这背后是哪些基因在起作用，又是如何在漫长的驯化历史中被“选中”的？为了解开这些谜团，由Jianjun Lu、Lianlian Hu、Wenbing Zhang、Cheng Pan、Donghai Li、Wei Fan、Jinbin Lin、Songbiao Chen、Peng Cui和Shiyou Lü组成的研究团队，开展了一项深入的研究，相关成果发表在《Plant Physiology and Biochemistry》上。
为了回答上述问题，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，构建了一个包含221份蓖麻材料的自然群体（其中26份为非洲野生短下胚轴材料，195份为中国栽培长下胚轴材料），并进行精确的表型测量和表皮细胞显微观察。其次，利用重测序数据（来自先前研究）进行了全基因组关联分析和选择性清除分析，采用遗传分化指数（Fst）、核苷酸多样性（π）和跨群体复合似然比（XP-CLR）等方法检测驯化选择信号。第三，选取代表性长短下胚轴材料，在其下胚轴最大伸长期，分离表皮组织进行RNA测序，分析差异表达基因。最后，通过酵母单杂交和启动子突变实验，对GWAS鉴定的关键候选基因的功能位点进行验证。
3.1. 比较野生与栽培蓖麻下胚轴的形态和细胞差异
研究人员对26份非洲野生短下胚轴材料和195份中国栽培长下胚轴材料进行了系统分析。表型统计显示，野生蓖麻群体的平均下胚轴长度显著短于中国栽培群体。对代表性材料‘s33’（长下胚轴）和‘Uganda’（短下胚轴）的生长动态监测发现，‘Uganda’在下胚轴7天时达到最大伸长速率，29天时停止伸长；而‘s33’在22天时达到最大速率，并持续伸长至55天，活性生长期延长了一倍。显微镜观察显示，在相同单位面积内，野生短下胚轴材料比栽培长下胚轴材料拥有更多的表皮细胞，但‘s33’的表皮细胞平均宽度和长度（50.46 μm和39.07 μm）显著大于‘Uganda’（26.80 μm和21.01 μm）。这些结果表明，下胚轴的伸长伴随着表皮细胞的伸长和扩展，而短下胚轴则表现为细胞更小、排列更密集。
3.2. 分析下胚轴伸长过程中的转录组表达差异
为了剖析调控下胚轴伸长的转录图谱，研究人员对‘Uganda’和‘s33’在最大下胚轴伸长期的表皮组织进行了比较转录组分析。共鉴定出2522个差异表达基因，其中1199个在‘Uganda’中表达被抑制，1323个被诱导。基因本体富集分析显示，这些基因显著富集于木葡聚糖木葡糖基转移酶活性、对植物激素的响应、对生长素的响应以及对激素的响应等功能类别。这些差异表达基因被系统地归类为以激素调控和细胞发育为核心的两个功能模块。在细胞发育相关基因中，鉴定出12个木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶基因、8个扩展蛋白基因和5个纤维素合酶基因的同源基因，它们在长下胚轴材料中表达更高。在激素调控方面，鉴定出13个生长素响应因子、7个SAUR基因、6个赤霉素受体基因、3个油菜素内酯不敏感1基因和1个光敏色素互作因子7基因等同源基因，它们分别参与生长素、脱落酸、赤霉素、油菜素内酯和乙烯等激素的信号转导。值得注意的是，转录组数据显示，在长下胚轴材料中，HY5及其同源基因HYH的表达水平更高，这与HY5作为光形态建成的负调控因子的经典功能看似矛盾。研究人员推测，这可能反映了在中国栽培蓖麻的育种选择中，可能偏爱增强了的光感知转录水平能力，这对于在次优光照条件下幼苗的建植至关重要。
3.3. 鉴定数千年下胚轴长度分化过程中的驯化选择信号
为验证这些差异表达基因是否在长期的栽培条件或野生自然萌发下经历了选择压力，研究人员分析了野生与栽培群体的遗传分歧时间和有效群体大小，并比较了它们的基因组选择信号。结果表明，两者的分歧时间可追溯到约16.25万年前。栽培蓖麻的群体规模在大约3260年前达到最大，暗示了大规模人工栽培的开始。利用Fst、π和XP-CLR三种互补方法，研究人员在全基因组范围内鉴定了受到驯化选择的基因组区域。通过整合这些受选择压力影响的基因，发现它们的功能富集于细胞壁松弛和细胞扩展相关过程，如细胞壁组织、细胞壁修饰等。进一步的功能注释将其中61个功能直系同源基因归入以下主要类别：25个生长素调控相关基因、7个细胞壁松弛相关基因和4个扩展蛋白基因。有趣的是，大多数差异表达基因或其同源基因都位于表现出选择信号的基因组区间内。例如，生长素响应基因SAUR36、ARF7、ARF8，以及细胞壁修饰基因XTH23、EXPB3等，都被检测到处于推测的选择压力阈值内。这些结果表明，选择作用靶向了控制激素驱动的细胞伸长和木葡聚糖内转葡糖基酶介导的细胞壁松弛的基因座，从而产生了野生与栽培材料之间观察到的下胚轴长度分化。
Fst值前10%筛选出的假定选择区域。(C)位于由π和Fst值前10%推断的假定选择区域内的基因的GO富集结果。(D)由π比值前10%推断的假定选择区域。(E)由Fst值前10%推断的假定选择区域。(F)由CLR分数前5%推断的假定选择区域。">
3.4. 下胚轴长度的全基因组关联研究
为了探究下胚轴伸长的潜在遗传机制，研究人员基于精确的下胚轴长度表型测量和高质量的单核苷酸多态性图谱进行了GWAS分析。共鉴定出79个与下胚轴伸长相关的SNPs，其中10个位于外显子区。基于GWAS分析结果，共确定了50个候选基因。在一个高置信度的连锁不平衡区块中，鉴定出15个基因，其中HY5和CESA1已被先前研究证实直接或间接与下胚轴伸长相关。在CESA1基因区域内，存在高密度的变异位点，基因型-表型关联分析表明，携带GTG单倍型的材料倾向于表现出更短的下胚轴，且该基因在长下胚轴材料‘s33’中的表达水平相对更高。此外，GWAS还揭示了其他一些与细胞扩展和植物激素调控相关的基因。通过将GWAS信号与选择性清除区域进行比对，研究人员鉴定出17个候选基因，包括HY5和CESA1，它们在控制下胚轴发育中起着关键作用。
3.5. 整合酵母单杂交、选择性清除和突变实验验证GWAS鉴定的HY5启动子变异对下胚轴长度调控至关重要
通过GWAS，研究人员还鉴定出另一个特征明确的基因HY5。在HY5基因的启动子区域鉴定出一个位于TGACG基序内的SNP。该基序是TGA家族转录因子的结合位点。研究人员假设该SNP通过调节TGA-HY5互作来调控下胚轴伸长。通过酵母单杂交实验，研究人员证实了TGACG-160是HY5启动子中的一个关键顺式调控元件，对于TGA1的结合至关重要，这也印证了GWAS结果的可靠性。因此，研究人员提出TGA1通过直接与TGACG-160互作来调节HY5的表达，从而通过TGA-HY5模块调控下胚轴伸长。此外，HY5所在的基因组区域也显示出高于预期的π值，并且超过了CLR分数的选择阈值，这强烈支持了选择压力在塑造表型性状中起主要作用的观点。
HY5的基因型变异和功能验证。(A)候选基因HY5的基因结构。(B,D)栽培与野生蓖麻材料中遗传变异的统计饼图。(C,E)候选基因HY5两种不同单倍型组间显著性检验的箱线图。(F)HY5启动子区示意图，显示推定的TGA1结合位点及其突变版本的位置。(G)TGA1与HY5启动子结合的酵母单杂交分析。(H)位于Rc29848支架上的GWAS信号。(I)经历了选择压力的基因组区域（由π比值推断）与GWAS峰值信号相关联。(J)经历了选择压力的基因组区域（由CLR分数推断）与GWAS峰值信号相关联。">
在讨论与结论部分，研究人员强调了人工驯化对作物性状形成的深远影响。他们认为，栽培蓖麻通常被深播，短下胚轴种质在出苗方面面临挑战，而长下胚轴种质则具有优势。因此，通过数千年的深播实践，蓖麻的遗传构成可能逐渐转变，导致长下胚轴种质占主导地位。本研究通过整合表型组、转录组、基因组和进化分析，揭示了下胚轴伸长背后的多基因选择足迹，并将TGA-HY5模块定位为该性状的潜在调控因子。这一框架为育种提供了全基因组靶点和表达标记，同时从进化角度揭示了光和激素信号组分如何在人类选择下被重新连接，以重塑蓖麻的幼苗结构。总之，这项研究通过耦合高分辨率表型分析、表皮特异性转录组、GWAS和全基因组选择扫描，揭示了蓖麻在数千年人类介导的驯化过程中形成的下胚轴伸长的多基因足迹。研究描绘了细胞和激素锚定的转录组图谱，检测到50个GWAS因果位点和61个可靠的选择信号，并功能验证了HY5启动子中一个顺式作用的TGACT基序变异通过提出的TGA-HY5模块调控下胚轴伸长。这些发现阐明了下胚轴发育的遗传结构和进化轨迹，新候选基因的表征为蓖麻的基础研究和分子育种开辟了至关重要的新途径。
