《Plant Physiology and Biochemistry》：Functional characterization of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) involved in the biosynthesis of triterpenoid saponins in
Platycodon grandiflorum
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本推荐介绍了一项关于传统中药桔梗活性成分合成调控的研究。为解决桔梗中三萜皂苷生物合成关键基因不明、调控机制不清的问题，研究人员首次在桔梗中系统性鉴定和表征了1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）基因家族成员（PgDXR1–PgDXR3）。研究揭示了PgDXR基因的组织特异性表达模式、对不同激素及干旱胁迫的响应、亚细胞定位，并证实PgDXR1在体外和体内（拟南芥）均能促进三萜皂苷前体MEP及终产物齐墩果酸的积累。此外，研究发现转录因子MYB39能结合并激活PgDXR1的启动子。该研究为深入阐明桔梗萜类化合物合成的分子调控机制奠定了重要基础，也为提升药用植物有效成分含量提供了新的理论依据和候选靶点。
桔梗，一种在东亚地区广泛使用的传统中药，其干燥根部富含多种药理活性成分，其中以齐墩果烷型三萜皂苷（例如桔梗皂苷D）为主要有效成分，具有抗炎、保肝、祛痰和抗癌等功效。随着市场对高质量天然药物需求的增长，如何通过生物技术手段提高药用植物中目标活性成分的含量，成为植物分子生物学和中药现代化研究的热点。萜类化合物是植物中种类最多的一类天然产物，其合成主要通过两条核心途径：位于细胞质的甲羟戊酸（MVA）途径和位于质体的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）是MEP途径中的一个关键限速酶，负责催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）向MEP的转化，从而调控整个下游萜类产物的合成通量。尽管DXR基因已在多种植物中被克隆和研究，但在重要药用植物桔梗中，其DXR基因家族尚未被鉴定，其在三萜皂苷生物合成中的具体功能和调控机制更是一片空白。这一知识缺口限制了我们通过基因工程手段精准调控桔梗皂苷合成的可能性。
为了填补这一空白，来自皖西大学生命与健康学院大别山中医药研究所的研究团队在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了一项研究，首次对桔梗中的DXR基因家族进行了全基因组鉴定和系统的功能解析。他们的目标明确：鉴定桔梗中的DXR基因，分析其表达特性，并探究其在三萜皂苷代谢中的生物学功能及上游调控机制。
为了回答这些问题，研究人员综合运用了生物信息学分析、分子克隆、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、原位杂交、蛋白质印迹（Western blot）、亚细胞定位、体外酶活测定、拟南芥遗传转化与代谢物检测（UPLC-MS/MS和HPLC）、酵母单杂交（Y1H）以及双荧光素酶报告基因（LUC）等一系列关键技术。研究材料包括不同生长年限（1年、2年、3年）的桔梗植株，以及用于异源功能验证的模式植物拟南芥和本氏烟草。
研究结果
3.1. PgDXR的序列分析及功能预测
研究人员从桔梗基因组中鉴定出三个DXR基因，命名为PgDXR1、PgDXR2和PgDXR3。它们的开放阅读框（ORF）长度、编码氨基酸数目、分子量和等电点均存在差异。系统发育树分析显示，PgDXR1与已报道可促进三萜皂苷合成的盾叶薯蓣DzDXR聚在同一分支，暗示PgDXR1可能具有类似功能。
3.2. 桔梗总皂苷含量分析
通过紫外分光光度法测定不同年限桔梗根、茎、叶中的总皂苷含量。结果显示，二年生桔梗根部的总皂苷含量最高，根部是桔梗三萜皂苷的主要积累部位。
3.3. PgDXR基因时空表达模式分析
qRT-PCR分析表明，三个PgDXR基因在不同组织和年限中的表达模式各异。其中，PgDXR1在二年生桔梗根部表达量最高，这与总皂苷的积累趋势一致。此外，PgDXR基因的表达受干旱（PEG6000模拟）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）等胁迫和激素处理的显著调控，表明它们可能参与植物的胁迫响应。
3.4. PgDXR蛋白亚细胞定位分析
通过将GFP（绿色荧光蛋白）融合蛋白在本氏烟草表皮细胞中瞬时表达，发现PgDXR1主要定位于叶绿体，而PgDXR2和PgDXR3则主要定位于细胞核和细胞质。这暗示了三个家族成员可能存在功能分化。
3.5. 原位杂交及Western blot分析
原位杂交进一步在组织水平证实了PgDXR基因的表达，其中PgDXR1在根部的表达最为显著和广泛。Western blot蛋白检测则直接证明，PgDXR1蛋白在二年生桔梗根部表达量最高。
3.6. PgDXR1酶活测定
体外酶活实验是关键一步。高效液相色谱（HPLC）结果显示，只有PgDXR1重组蛋白能够有效地将底物DXP催化转化为产物MEP，而PgDXR2和PgDXR3则未检测到明显的酶催化活性，提示它们可能是功能退化的假基因或需要特定条件激活。
3.7. 转基因植物中DXP/MEP及齐墩果酸含量测定
为了在体内验证PgDXR1的功能，研究人员将PgDXR1基因转入拟南芥中过表达。超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析显示，转基因拟南芥中MEP的含量显著高于野生型，证实PgDXR1的表达促进了MEP的合成。更重要的是，HPLC检测发现转基因拟南芥中三萜皂苷的主要苷元齐墩果酸的含量也显著升高（约为野生型的1.06倍）。此外，在桔梗中的瞬时过表达实验也直接证明PgDXR1能提高总皂苷含量。这些结果强有力地表明PgDXR1能促进三萜皂苷的生物合成。
3.8. 酵母单杂交实验
为了探究PgDXR1的上游调控机制，研究人员基于转录组数据筛选出差异表达的转录因子MYB39。酵母单杂交实验证明，MYB39能够直接结合到PgDXR1基因的启动子区域。
3.9. 双荧光素酶报告基因实验
双荧光素酶报告基因实验在本氏烟草叶片中进行，进一步证实MYB39对PgDXR1启动子具有显著的转录激活作用，从而在分子水平上阐明了MYB39通过激活PgDXR1表达来调控三萜皂苷合成的通路。
研究结论与重要意义
本研究首次在药用植物桔梗中全基因组鉴定了三个DXR基因（PgDXR1–PgDXR3），并对其进行了系统的功能表征。主要结论包括：
- 1.
PgDXR基因具有组织特异性表达模式，其中PgDXR1的表达与三萜皂苷的积累高度相关，且在二年生根部最为显著。
- 2.
PgDXR基因的表达受多种非生物胁迫和激素诱导，提示其参与植物的胁迫应答。
- 3.
三个PgDXR蛋白的亚细胞定位不同，PgDXR1定位于叶绿体，与MEP途径的场所一致。
- 4.
体外和体内功能验证均证实，PgDXR1具有酶催化活性，并能有效促进三萜皂苷前体MEP及终产物齐墩果酸的积累，是调控桔梗皂苷合成的关键正向调控因子。
- 5.
发现了上游转录因子MYB39，它通过直接结合并激活PgDXR1的启动子，从而形成了一条从转录调控到代谢通路的完整调控链（MYB39 → PgDXR1→ MEP途径 → 三萜皂苷）。
这项研究的意义深远。首先，它填补了桔梗萜类生物合成途径中关键限速酶基因研究的空白，将MEP途径与桔梗的主要药用成分三萜皂苷的合成直接联系起来。其次，研究不仅鉴定了一个关键酶基因，还挖掘了其上游转录调控因子，为理解桔梗皂苷合成的复杂调控网络提供了全新视角。从应用角度看，PgDXR1和MYB39均可作为潜在的分子育种靶点。通过基因编辑或过表达技术调控这些基因，有望培育出皂苷含量更高的桔梗新品种，从而提升药材品质和产量，满足市场需求。此外，该研究建立的系统研究方法也为其他药用植物活性成分合成途径的解析提供了可借鉴的范式。总之，这项工作为桔梗的分子育种和活性成分的生物合成调控奠定了坚实的理论基础，是中药现代化和合成生物学研究中的一个重要进展。
