《Plant Science》：Overexpression of the
Mentha canadensis McTTG2 gene positively regulates trichome development and proanthocyanidins biosynthesis in transgenic Arabidopsis
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WRKY转录因子调控薄荷气孔毛形成与花青素合成。通过构建拟南芥ttg2-7突变体过表达体系，发现McTTG2显著增加气孔毛数量并促进花青素积累，同时激活GL2、TRY等气孔毛形成相关基因及TT12、TT13等花青素合成基因，酵母自激活和双 luciferase 检测证实其直接调控这些基因表达。
杨白|徐一川|齐西武|李莉|徐宇|方海玲|刘东梅|陈飞|梁成远
中国科学院江苏省植物研究所（南京中山植物园）江苏省植物资源保护与利用重点实验室，中国江苏南京
摘要
WRKY转录因子在植物发育和生长过程中起着关键作用，同时参与应激反应和代谢过程。因此，许多植物物种中都发现了WRKY家族的成员；然而，关于薄荷（Mentha canadensis）中WRKY家族的研究报告却很少。因此，本研究通过系统发育分析鉴定出一个名为McTTG2的薄荷WRKY I组成员基因。McTTG2在植物的营养器官和生殖器官中广泛表达，编码一种核蛋白，在酵母细胞中不具有自我转录激活活性。通过异源互补实验发现，McTTG2在Arabidopsis thaliana ttg2-7突变体中过表达，显著增加了毛状体的数量和原花青素（PA）的积累。与McTTG2过表达株系的表型一致，几个参与毛状体形成的关键基因（如AtGL2、AtTRY和AtBRK1）以及PA生物合成基因（包括AtTT12和AtTT13）的表达也发生了变化。Y1H和双荧光素酶实验表明，McTTG2能够结合这些基因的启动子并激活其表达。这些结果表明，McTTG2通过调控与毛状体形成（AtGL2、AtTRY和AtBRK1）和PA生物合成（AtTT12和AtTT13）相关的基因表达，从而正向调控毛状体的发育和PA的生物合成。
引言
WRKY转录因子（TFs）是植物中最大的转录因子家族之一，其特征是在N端具有高度保守的WRKYGQK基序，在C端具有C2H2或C2HC锌指结构（Rushton等人，2010年；Wang等人，2023年）。WRKYGQK基序和锌指结构对于序列特异性识别及其与典型cis作用元件W-box元件（C/TTGACC/T）的亲和力至关重要（Eulgem等人，2000年）。根据WRKY结构域的数量和锌指结构类型，WRKY TFs被分为三大类：I类（包含两个WRKY结构域和一个C2H2基序）、II类（包含一个WRKY结构域和一个C2H2基序）和III类（包含一个WRKY结构域和一个C2CH基序）。II类进一步细分为五个亚类（IIa、IIb、IIc、IId和IIe）（Rinerson等人，2015年；Wang等人，2023年）。WRKY TFs在植物生长、发育、代谢以及对各种生物和非生物胁迫的响应中发挥着重要作用（Meraj等人，2020年；Wang等人，2023年；Wei等人，2023年；Zhang等人，2023a年；Mahiwal等人，2024年）。
植物毛状体是表皮突起，具有形态、功能和代谢能力的巨大多样性。广义上，它们可以分为单细胞非腺体结构或多细胞腺体结构。拟南芥的毛状体属于前者类型，主要提供物理防御作用，不是大量次生代谢产物合成的场所（Ishida等人，2007年）。相比之下，许多药用植物会发育出多细胞腺体毛状体（盾状和头状），这些毛状体作为专门的生化工厂，用于大规模合成和储存特定的代谢产物（Huchelmann等人，2017年）。
WRKY转录因子是众所周知的生物和非生物胁迫响应调节因子，但越来越多的证据表明它们在毛状体发育和次生代谢中起着核心协调作用。拟南芥中的创始成员TTG2（WRKY44）在MYB-bHLH-WD40（MBW）复合体下游发挥作用，激活GLABRA 2（GL2）和负调控因子TRYPTICHON（TRY），从而决定毛状体的间距和形态（Johnson等人，2002年；Pesch等人，2014年）。此外，AtTTG2对拟南芥种皮中的PA和黏液的生物合成至关重要（Debeaujon等人，2003年；Gonzalez等人，2009年；Gonzalez等人，2016年；Li等人，2020b年；Allen等人，2023年）。重要的是，在积累代谢产物的物种中进行的研究表明，WRKY蛋白可以同时促进腺体毛状体的形成和代谢通量。例如，Artemisia annua中的AaGSW2（WRKY17）直接转激活GL3（毛状体形成）和ADS（青蒿素生物合成）基因，将形态分化与倍半萜类化合物的产生联系起来（Xie等人，2022年）。类似地，猕猴桃中的AcWRKY44在腺体毛状体内切换花青素与原花青素的生物合成，以平衡色素沉着和化学防御（Peng等人，2020年）。这些发现表明，WRKY TFs，尤其是TTG2，将毛状体发育与特定代谢产物的合成整合在一起。
Mentha canadensis L. 是一种广泛栽培的药用草本植物和香料作物，具有很高的经济价值，可用于生产精油（He等人，2019年）。尽管腺体毛状体对薄荷精油的生产至关重要，但调控M. canadensis中腺体毛状体发育和次生代谢的机制仍很大程度上尚未被探索。特别是，薄荷中的TTG2同源基因尚未被鉴定和功能研究。由于M. canadensis的遗传转化技术具有挑战性，我们采用了拟南芥中的异源表达系统来研究其TTG2同源基因的功能。在本研究中，我们鉴定并表征了来自M. canadensis的WRKY I组转录因子McTTG2。我们分析了其转录模式、亚细胞分布和自我转录激活活性。此外，我们在拟南芥ttg2-7突变体中过表达McTTG2基因，以研究其在毛状体发育和PA生物合成中的作用。我们的发现为理解TTG2同源基因的保守和差异功能提供了见解，并为未来关于薄荷中腺体毛状体发育和精油生物合成的研究奠定了基础。
植物材料及生长条件
M. canadensis和烟草植物在蛭石与营养土（1:2，v/v）的混合物中培养，温度为25℃，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。拟南芥种子经过灭菌后播种在含有1%蔗糖和1%琼脂的1/2 Murashige和Skoog（MS）培养基上；在4°C下浸泡2天后，转移到光照周期为14小时光照/10小时黑暗、温度为22°C的生长室中。拟南芥Col-0生态型作为野生型对照，AtTTG2的T-DNA插入系（SALK_206852C，ttg2-7）也在该培养基中培养
从M. canadensis中分离McTTG2并进行序列分析
讨论
WRKY转录因子调节植物发育、应激响应和次生代谢产物的生物合成（Zhang等人，2023a年；Yang等人，2025年）。在本研究中，基于同源性比对结果（图1），鉴定并命名了一个来自M. canadensis的新WRKY I组成员McTTG2。该McTTG2在转基因拟南芥中进行了筛选和研究。拟南芥中的TTG2在毛状体发育和黄酮类化合物生物合成中起关键作用（Johnson等人，2002年；Gonzalez等人
未引用的参考文献
(Dilkes等人，2008年；Garcia等人，2005年；Li等人，2020a年；Xie等人，2021年；Zhao等人，2008年)
资助
本研究得到了中国国家自然科学基金[项目编号32100313]、江苏省自然科学基金[项目编号BK20210164]以及江苏省植物资源保护与利用重点实验室[项目编号JSPKLB202029和JSPKLB202412]对YB的支持；中国国家自然科学基金[项目编号32370397]对CYL的支持；以及中国国家自然科学基金[项目编号32200302]对XY的支持。
CRediT作者贡献声明
陈飞：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 原稿。 梁成远：项目管理。 杨白：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 原稿；研究；概念构思。 徐一川：研究。 齐西武：正式分析。 李莉：可视化；正式分析。 徐宇：资源获取。 方海玲：撰写 – 审稿与编辑。 刘东梅：撰写 – 审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
