《Plant Science》：Fvchli Deficiency Impairs ABA-Mediated Stomatal Closure and Enhances Susceptibility to
Xanthomonas fragariae in Strawberry
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镁叶绿素原合酶亚基CHLI在草莓中通过CRISPR/Cas9编辑，发现其编辑效率与对Xanthomonas fragariae的感病性正相关，表现为ABA积累减少、气孔关闭能力下降，促进病原菌定殖。
Jingnan Luo|Jiangsong Jin|Yangyang Ma|Yanwen Jiang|Fengxue Zhu|Lanyan Zhang|Yingqiang Wen|Jiayue Feng
中国西北农林科技大学园艺学院作物抗逆与高效生产国家重点实验室，延安712100
摘要
镁螯合酶亚基CHLI在叶绿素生物合成中的作用已经得到充分研究，但其在植物免疫中的作用尚不清楚。在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9技术生成了嵌合的Fvchli突变草莓，并通过自交获得了具有不同编辑效率的T1-T3代后代。编辑效率较高的突变体表现出更多的叶斑病。接种Xanthomonas fragariae后，Fvchli突变体的易感性增加，病变面积和发病率与编辑效率呈正相关。进一步实验表明，与野生型相比，Fvchli突变体的气孔在ABA作用下闭合速度显著减慢。经过1.5小时的ABA处理后，野生型的气孔开口率（宽度与长度之比）从32%降至2.3%，而编辑效率为70%的突变体气孔开口率仅从32%降至16%。在编辑过的植物中，与ABA生物合成和信号传导相关的基因表达水平显著低于野生型。病原体感染后，野生型和突变体植物的ABA水平均有所升高，但Fvchli突变体的ABA水平仍显著较低。扫描电子显微镜观察发现，Fvchli突变体在感染后5小时和12小时的气孔开口更宽，有利于细菌的广泛定殖，而野生型植物则通过气孔闭合有效限制了细菌入侵。
引言
CHLI（MgCh I亚基）是镁螯合酶的一个亚基，负责催化Mg2?插入原卟啉IX的分子过程（Walker和Weinstein，1991；Tanaka和Tanaka，2007）。原卟啉IX是叶绿素和血红素生物合成途径的最后一步的共同前体。因此，镁螯合酶是叶绿素生物合成途径中的关键限速酶（Zhang等人，2021）。镁螯合酶的另外两个亚基是CHLD和CHLH（Jensen等人，1996）。CHLI是一个ATP酶亚基，通过ATP水解为螯合反应提供能量。其结构包含一个AAA?结构域和一个P环（核苷酸结合位点），并形成六聚体以发挥ATP水解活性（Gibson等人，1995；Reid和Hunter，2004）。CHLI的功能丧失或点突变会显著影响叶绿素合成，导致叶片黄化或白化（Koncz等人，1990；Hansson等人，1999；Huang等人，2009；Gao等人，2016；Ma等人，2023）。脱落酸（ABA）是一种对植物生长和发育至关重要的植物激素，有助于植物适应环境挑战（Collin和Daszkowska-Golec，2025）。Chli突变体也表现出对ABA的敏感性降低，而CHLI1基因的上调则增强了拟南芥种子萌发过程中的ABA敏感性（Du等人，2012）。在拟南芥中，CHLI敲除突变体表现出与CHLH突变体相似的ABA不敏感表型（Tsuzuki等人，2011；Tomiyama等人，2014）。
气孔是植物吸收CO?、释放光合作用产生的氧气以及通过蒸腾作用失水的主要通道（Assmann和Jegla，2016）。植物通过感知和响应环境刺激来调节气孔开口大小，这显著影响其生长、发育和抗逆能力（Wang和Chang，2024）。各种生物和非生物胁迫因素通过调节ABA的生物合成和信号传导途径来诱导气孔闭合。干旱胁迫促进ABA生物合成，导致气孔闭合和导度降低（Saradadevi等人，2017）。高CO?水平会诱导某些ABA受体家族成员的表达，从而促进气孔闭合（Dittrich等人，2019）。病原体感染会触发转录因子LeJA2的表达，该因子直接上调ABA生物合成基因LeNCED1，导致ABA积累增加和随后的气孔闭合（Du等人，2014）。Paenibacillus syringae Pst DC3000通过分泌冠菌素抑制ABA信号，促使植物重新打开气孔，从而帮助其侵入（Liu等人，2024）。
草莓（Fragaria × ananassa）是一种多年生常绿草本植物，作为重要的经济水果作物在全球广泛栽培（Hernández-Martínez等人，2023）。Xanthomonas fragariae通常引起草莓的角斑病（ALS），这是一种在许多草莓生产区普遍存在的严重细菌性疾病，现已成为影响草莓生产的主要问题（Wang等人，2017；Li等人，2021）。根据统计，1994年和1995年美国佛罗里达州的草莓市场产量分别下降了8.6%和7.7%，原因是角斑病（Roberts等人，1997）。2007年，在墨西哥最重要的草莓生产州米却肯，平均发病率达到80%，造成了重大损失（Fernández-Pavía等人，2014）。2017年秋季，中国辽宁省的发病率约为5%至10%，但在一些受严重影响的温室中可达到30%至40%。在中国云南省的玉溪和昆明等主要草莓生产区，2021年的平均发病率为10%至20%，严重受影响的地区发病率可达40%（Zhang等人，2022）。Xanthomonas fragariae于1962年首次在美国被鉴定为引起叶斑病的病原体，此后在其他地区也有发现，有时会出现新的症状（Li等人，2021）。Xanthomonas fragariae主要通过气孔和伤口进入草莓叶片组织，在叶肉细胞的细胞间隙中定殖，最初受到维管束的限制，随后导致植物细胞膜与细胞壁分离。它在细胞间隙中大量繁殖，并最终从叶片气孔中渗出（Allan-Wojtas等人，2010）。侵入叶片后，Xanthomonas fragariae还可以沿叶柄扩散到茎部，引起茎部空洞症状（Wang等人，2023）。
虽然CHLI在叶绿素生物合成中的功能已知，但其在植物抵御病原体方面的作用尚不清楚。为了解决这一空白，我们利用CRISPR/Cas9技术生成了具有不同编辑效率的Fragaria vesca Fvchli突变体。通过研究它们对Xanthomonas fragariae的易感性、气孔动态和ABA反应，本研究旨在阐明CHLI是否通过调节ABA依赖的气孔防御途径在植物免疫中起关键作用。
植物材料与生长条件
实验材料为二倍体草莓Fragaria vesca ‘Rügen’。所有植物都在控制条件下在生长室中培养：温度25°C，光照16小时/黑暗8小时，相对湿度70%。植物种植在由土壤、蛭石和珍珠岩按3:1:1体积比配制的培养基中。
载体构建和植物转化
用于序列扩增的cDNA是通过反转录Fragaria vesca幼叶提取的RNA获得的
嵌合Fvchli突变体产生具有多种编辑类型和效率的后代
我们利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术生成了草莓chli突变体（图1，A和B）。这些植物的叶片上出现了白色斑点（Ma等人，2023）。我们选择了一株chli突变体进行自交，通过下一代测序确认其为编辑效率为15%的嵌合体，并将其命名为ΔchliT0。这产生了45株T1代后代，其中40株为编辑体，5株为野生型。观察到了T1代中的不同编辑类型和效率
讨论
CHLI是关键叶绿素生物合成酶镁螯合酶的一个亚基，已被广泛研究（Adams等人，2020），但其与植物抗病性的关系尚未报道。CHLI的功能丧失或点突变会显著影响叶绿素合成，导致叶片黄化或白化（Zhao等人，2024）。我们生成的Fvchli突变体表现出白色斑点，而不是均匀的白化或黄色叶片，这可能是由于其嵌合性质所致
结论
总之，我们的研究表明，Fvchli的功能障碍以编辑效率依赖的方式增强了草莓对X. fragariae的敏感性。我们提供了机制证据，证明Fvchli突变导致ABA介导的气孔闭合敏感性降低和病原体诱导的ABA积累受损。这种缺陷导致细菌感染期间气孔开口变宽，从而促进病原体的进入和定殖。这些发现揭示了Fvchli在植物中的新功能
作者贡献声明
作者们没有需要声明的利益冲突。YW和JYF负责实验设计并协调研究工作。JNL、JSJ和YYM进行了实验。JNL撰写了手稿。YWJ、FXZ和LYZ进行了数据分析。
未引用的参考文献
(Finkelstein, 2013; Huang and Li, 2009; Chi et al., 2015)
资助
本研究得到了陕西省重点研发计划（2023-YBNY-059）的支持。
CRediT作者贡献声明
Lanyan Zhang：正式分析，数据管理。Fengxue Zhu：正式分析，数据管理。Jiayue Feng：监督，项目管理，资金获取，概念构思。Yingqiang Wen：写作——审阅与编辑，监督，资金获取，概念构思。Jiangsong Jin：调查，正式分析，数据管理。Jingnan Luo：写作——初稿，方法学，数据管理。Yanwen Jiang：正式分析，数据管理。Yangyang Ma：方法学，调查
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢西北农林科技大学园艺科学研究中心的Ruihong Chen博士在场发射扫描电子显微镜（Hitachi SU5000）方面的专业协助。同时感谢Yangyang Yuan在共聚焦显微镜（LEICA TCS SP8，德国）方面的技术支持。此外，我们也感谢Jing Zhao在使用高效液相色谱-串联质谱（Agilent 1290）进行分析方面所做的贡献
