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本文综述了视网膜研究领域尚未解决的关键科学问题，涵盖光感受器信号传导、细胞突触机制、神经回路网络以及神经调制等多个层面，旨在为下一代研究者指明方向。
尚未解决的视网膜问题
由John E. Dowling、Frank S. Werblin与Samuel M. Wu三位资深科学家撰写的这篇综述文章，系统性地回顾了现代视网膜研究在过去六十余年中取得的关键进展，并着重梳理了该领域目前仍悬而未决的核心科学问题。文章以光感受器为起点，依次探讨了水平细胞、双极细胞、无长突细胞和神经节细胞，并特别关注了神经调制作用，为未来的研究方向绘制了一幅详尽的蓝图。
引言：大脑的延伸
视网膜本质上是大脑的一部分，在发育过程中被推向眼内。对它的研究极大地增进了我们对脑机制的理解。尽管视网膜常被认为是中枢神经系统（CNS）中被理解最透彻的部分，但仍有大量谜团待解。本文旨在指出一系列未解之谜，并简要介绍当前已知的背景知识，明确待解决的问题。
光感受器
关于光感受器如何运作、对光的敏感性以及它们形成的突触，存在许多有趣的未解问题。例如，脊椎动物的光感受器在黑暗中处于部分去极化状态，通过外段cGMP门控通道的Na+内流实现。这种设置允许光感受器在接近其暗电位的区域产生更大的微光突触后反应，因为其输入-输出关系是非线性的，在去极化的暗电位附近增益最高。光照关闭外段Na+通道，使细胞超极化，从而抑制其递质L-谷氨酸的暗释放。谷氨酸的释放是钙依赖性的，而光感受器中的钙激活曲线在暗电位附近斜率最大，导致该电压区域的突触增益最高。因此，光感受器在黑暗中释放递质，而传递给二级细胞的信号则是通过递质的减少来实现。这引出了一个根本性问题：为何脊椎动物光感受器以这种“光照减少递质”的独特方式工作？在中枢神经系统的其他部分，神经元通常在去极化时释放递质。这种工作方式是否具有优势？持续在黑暗中保持活跃显然会消耗大量能量。
视觉适应
当通过饮食（如维生素A缺乏）或光照漂白减少视杆细胞中的光敏视色素水平时，视网膜的敏感度会下降，但下降并非线性关系。例如，损失一半视色素，光敏感度并非下降2倍（0.3 log单位），而是下降2000-3000倍（2-3 log单位）。我们现在知道，漂白的色素蛋白（视蛋白）能微弱激活G蛋白转导素和信号转导级联反应，其效果类似于有微弱光照在视网膜上。
另一方面，当背景光照射到大鼠或人眼时，光敏感度随光强线性下降，这就是著名的韦伯-费希纳增量阈值关系。 数据显示，直到背景光强足以漂白大量视色素（>10%），漂白才开始显著影响暗适应的速率和程度。在不足以漂白大量视色素的微弱背景光下，增量阈值仍可被提高多达3个log单位或更多。这种光敏感度的显著下降原因尚不明确，需要研究。
暗适应由两个部分组成：一个初始的快速阶段（神经适应），以及一个较慢的成分（光化学适应）。慢速阶段取决于视色素水平和再生速度，而光感受器中神经暗适应的机制仍然未知，需要深入研究。
视杆细胞饱和与网络适应
众所周知，当视杆细胞暴露在明亮的背景光下时会饱和，对任何强度的闪光都变得完全没有反应。然而，在鳐鱼（skate）的全视杆细胞视网膜中发现，在饱和背景光下等待约10-15分钟后，视杆细胞会重新开始反应，逐渐恢复部分光敏感度和反应幅度。近期研究表明，小鼠视杆细胞也有同样现象。是否所有物种的视杆细胞都如此尚不清楚。其机制可能与G蛋白转导素在光照下从外段向内段的移动有关，也可能涉及视紫红质的光再生。
此外，实验表明，在非常微弱的背景光下，视网膜光敏感度的显著变化可能并非源于光感受器本身。在鳐鱼的研究中，微弱的背景光下，视网膜电图（ERG）的视杆敏感度和水平细胞反应均未观察到变化，但反映双极细胞活动的ERG b波和给光-神经节细胞放电却显示出光敏感度的显著下降，这表明内层视网膜存在一种在外层视网膜看不到的网络适应机制。目前对这一网络适应机制或所涉及的细胞/突触知之甚少，钾离子积累可能是一个因素。
光感受器突触
光感受器形成的突触也有一些有趣且不寻常的特征。例如，视杆和视锥细胞形成的兴奋性突触都位于其终末基底面的内陷结构之内。 电子致密的突触带就位于内陷上方，递质（L-谷氨酸）从突触带下方的突触前膜释放。来自二级给光-双极细胞的树突和水平细胞的突起伸入内陷以接收来自光感受器的输入。长期以来，人们推测这种内陷结构促进了光感受器、给光-双极细胞和水平细胞之间的相互作用，但这些相互作用的本质是什么？此外，还有位于内陷外的扁平或基底突触，它们与超极化（撒光）的双极细胞树突形成连接。这些连接处没有聚集的突触小泡或突触带。
这些基底突触如何激活突触后结构？一种猜测是通过“溢出”机制，即从内陷上方的突触带释放的递质以某种方式到达基底连接处，但这仍不确定。在斑马鱼的 nrc突变体中，没有典型的内陷或带状突触，但基底连接存在，并且撒光-双极细胞和撒光-神经节细胞被激活，这提示可能存在另一种机制。如果存在另一种机制，又引出了新的问题：因为没有观察到突触前有突触小泡聚集，递质是否不是像典型中枢神经系统突触那样通过小泡释放？有人提出可能是通过反向转运机制释放，但这也是推测，尚未证实。
最后，带状突触为何是内陷的？一个可能原因是其几何上曲折的结构减缓了突触间隙中谷氨酸的扩散，从而塑造了突触反应；第二个原因可能是内陷将一个释放位点与另一个隔离开来，从而避免了相邻突触带同步囊泡释放的混合。
视网膜细胞及其突触/药理学
脊椎动物视网膜中有四类神经元，它们形成两个突触层：外层视网膜的外丛状层，主要处理视觉图像的空间和颜色信息；内层视网膜的内丛状层，主要处理图像的时间和动态方面。
虽然每一类视网膜细胞在解剖和生理上都可清楚区分，但每类中又存在许多亚型。例如，水平细胞亚型最少（2-4种），而无长突细胞亚型最多，可达50-70种。亚型分类方法多样，从经典的形态学（如高尔基染色）到生理学标准，再到现代的RNA表达谱（scRNA-seq）分析。但每种方法都存在挑战：例如，形态会随视网膜区域变化，而RNA表达可能受神经活性物质（如视黄酸）或神经元连接的不同大脑靶区影响。因此，一个能够整合形态、反应特性、递质含量、遗传标记以及特定输入输出连接的综合分类方案，仍是一个挑战。
水平细胞
水平细胞是二级神经元，作为侧向成分在光感受器内陷中直接接收光感受器输入。它们主要形成三种突触：反馈突触、电突触和可能的前馈突触。
水平细胞反馈突触
水平细胞向光感受器（主要是视锥细胞）提供抑制性反馈的证据已存在50多年，但从未观察到其解剖结构证据。目前提出了两种非常规机制来解释这种反馈，均有证据支持，但孰是孰非，或两者兼有，尚未得到证实。一种机制认为，水平细胞在光照下超极化会打开一个通道，允许正电流从水平细胞突起流入光感受器内陷，从而去极化光感受器突触前膜，增强钙依赖的谷氨酸释放。第二种机制认为，水平细胞的超极化提高了内陷中的pH值（负值增加），导致依赖pH的Ca2+电流流入光感受器终末，从而增加谷氨酸释放。 最近一项研究发现钠-碳酸氢盐协同转运蛋白（Slc4a5）参与此反馈信号，这一发现与pH机制一致。第三种机制提出，在某些含有GABA的水平细胞中，GABA激活的氯电流可以介导水平细胞引起的视锥细胞去极化。所有这些机制都提示了光感受器终末内陷结构的另一个可能原因：即限制所提出的电流流动。
电突触
水平细胞之间通过大的缝隙连接相互耦合，这显著扩大了单个水平细胞的感受野。这些连接受多巴胺、一氧化氮甚至视黄酸等神经调节物质的调节。此外，视杆和视锥细胞之间存在电耦合，并受多巴胺调节的昼夜节律控制。另一个显著的缝隙连接存在于一种无长突细胞（A2细胞）和给光-双极细胞终末之间，这在哺乳动物的视杆信号通路中至关重要。
水平细胞前馈突触
关于水平细胞到双极细胞的前馈突触性质，人们了解得更少。尽管在猫和泥螈的视网膜中观察到可能的化学突触解剖证据，但在大多数视网膜中并未看到。如果存在，其功能也不明确。有研究表明，在蝾螈视网膜中，应用L-AP4阻断视锥到给光-双极细胞的突触后，给光-双极细胞会产生持续的超极化反应，这可能由水平细胞通过保号性的电突触介导。如果前馈突触主要是电突触，这可以解释为何在大多数视网膜中看不到经典的前馈化学突触。显然，需要对可能存在的水平细胞到双极细胞的前馈突触进行进一步研究。
双极细胞
双极细胞将视觉信息从外层视网膜传递到内层视网膜，它们作为兴奋性神经元，向给光-和撒光-神经节细胞释放L-谷氨酸。然而，相当数量的双极细胞（约10%）含有抑制性递质GABA，少数含有甘氨酸。含GABA的双极细胞的功能尚不完全清楚。
双极细胞主要分为两大类：给光-双极细胞在光照下去极化，撒光-双极细胞在光照下超极化。它们的终末一般终止于内丛状层的两个主要亚层中。在哺乳动物中，通常有10-12种视锥双极细胞亚型，而视杆双极细胞全部终止于给光亚层的最下部，与A2无长突细胞形成连接。因此，内丛状层中大约有10-20个亚层，不同类型的神经节细胞在其中接收来自双极细胞和无长突细胞的输入。
各种类型的双极细胞在记录光反应时表现出不同的波形。但由于双极细胞接收来自无长突细胞的强大输入，这些波形的多样性有多少是双极细胞亚型固有的，又有多少来自同样具有多样波形的无长突细胞的输入，目前尚不清楚。有研究表明，当阻断GABAC受体，将双极细胞与无长突细胞和水平细胞的输入隔离时，所有双极细胞可能都以基本相同的持续分级电位（给光细胞去极化，撒光细胞超极化）作出反应，但这仍需证实。
中心-周边组织
所有脊椎动物的给光-和撒光-双极细胞都具有明显的中心-周边拮抗感受野：给光-双极细胞对中心光照去极化，对周边光照超极化（中心给光/周边撒光）；撒光-双极细胞则相反（中心撒光/周边给光）。人们普遍认为，双极细胞的周边反应源于水平细胞对中心反应的拮抗，这使得双极细胞成为视觉系统中第一个表现出显著中心-周边拮抗作用的细胞。一个奇怪的现象是，仅由周边光照引起的拮抗反应在黑暗中无法看到，而只能在同时存在中心光的情况下观察到。这令人惊讶，因为在黑暗中突触传递是最强的。这种在缺乏中心光情况下的周边反应，在视锥细胞、双极细胞或神经节细胞中均未观察到。其机制尚不清楚，值得系统研究。
无长突细胞
就神经元亚型而言，无长突细胞是所有视网膜细胞中数量最多、种类最多样、最异质的一类。在哺乳动物中，已提出超过60种亚型，在非哺乳动物脊椎动物视网膜中甚至多达70种。为何有如此多的无长突细胞？因为它们显然参与了视觉信息的复杂处理。
大多数无长突细胞以去极化电位（瞬态或持续性）响应光照。它们的形态和连接方式也极为多样，既有分层的，也有弥散的。它们在突触形成上非常多样化，可以形成反馈、前馈、交互以及串联突触，既有化学突触也有电突触。理解内丛状层各亚层中无长突细胞的连接，是理解视网膜布线及各种生理类型神经节细胞产生的关键。
特定无长突细胞的功能
特定的无长突细胞类型被证明参与特定的视觉功能。例如，甘氨酸能无长突细胞介导给光-和撒光-通路之间的“交叉”抑制，有助于消除双极细胞信号的非线性整流，使神经节细胞对光增量的反应更线性。另一种称为“星爆细胞”的无长突细胞，是产生某些神经节细胞运动方向选择性的关键组成部分。还有一类广泛分布的无长突细胞，在光照的给光和撒光时均产生瞬态反应，可能在眼球扫视等全局光照变化时短暂抑制神经节细胞活动。另一个例子是参与检测逼近物体（looming）的回路，其中A2无长突细胞扮演了关键角色。这些例子说明了对更多乃至所有“类型”无长突细胞进行具体回路和功能研究的必要性，才能真正建立有意义的分类方案。
神经调制
大多数无长突细胞含有并释放GABA或甘氨酸，但许多其他神经活性物质也存在于GABA能无长突细胞中。这些物质主要作为神经调质，通过不同机制以各种方式调节神经活动。理解神经调制可能是我们关于视网膜和大脑功能最大的未知领域。
视网膜中已识别出两大类神经调质：单胺类和神经肽类。目前对单胺类（尤其是多巴胺）的了解较多。多巴胺通过激活腺苷酸环化酶产生第二信使cAMP，进而激活PKA来磷酸化（或去磷酸化）蛋白质，从而改变缝隙连接通道的电导，也能调节水平细胞上谷氨酸通道的敏感性。多巴胺的神经调制（可能与其他神经调质协同）是视网膜许多昼夜节律的基础，包括明暗条件下视杆与视锥视觉的切换、整体视网膜敏感性的调节以及中心-周边强度的调整等。其他物质如NO、大麻素、锌、腺苷和视黄酸也具有神经调制作用，视黄酸似乎能不通过第二信使系统直接作用于缝隙连接蛋白以改变其电导。
神经肽
视网膜中最神秘的神经活性物质是神经肽。它们在视网膜和大脑功能中的作用几乎完全未知。神经肽是视网膜中发现的种类最多的神经活性物质群，至少有15种不同的神经肽，几乎只存在于无长突细胞中，并且通常与GABA共存。一般认为，神经肽主要起调制作用，但也能像经典兴奋性神经递质一样直接去极化突触后细胞。例如，视网膜中的VIP既能增加水平细胞中的cAMP，也能直接使水平细胞去极化。神经肽如何被释放、在哪里发挥作用也各不相同，它们可能作用于远离释放神经元数微米的细胞。为何神经肽通常与GABA或甘氨酸共存于无长突细胞中？这一领域需要大量研究工作。
神经节细胞
神经节细胞是视网膜的输出神经元，将视网膜感知和处理后的视觉信息传递到高级视觉中枢。视网膜中存在大量神经节细胞亚型。除了少数参与非成像视觉功能（如瞳孔对光反射、昼夜节律调节）的感光神经节细胞（ipRGCs）可能向含多巴胺的细胞提供反馈外，大多数神经节细胞并不参与视觉信息的感知和处理，它们是依赖于光感受器、水平细胞、双极细胞和无长突细胞的连接与相互作用的“读出”细胞。
不同的神经节细胞类型携带着动物所能获取的所有视觉信息。在哺乳动物视网膜中，可能有多达20-30种亚型，它们在解剖和生理上各不相同，并将其轴突投射到大脑的不同部位。这些表征中蕴含着一个构成动物视觉世界基础的完整编码，其丰富的神经语言我们尚未完全理解。利用现代的连接组学技术，我们有可能揭示内丛状层各亚层中兴奋和抑制的精确布线。然而，目前神经调制突触大多无法在连接组学研究中被识别，因此，连接组学研究可以提供神经网络基础布线的良好概念，但无法提供关于可能发生的各种突触相互作用的完整信息。
结论
尽管我们对视网膜及其功能已有了大量了解，但仍有更多未知等待探索。视网膜是一个研究资源极其丰富的领域。随着未来新方法的发展，如同时测量多个神经元细胞内活动、利用AI方法分析复杂数据、以及构建受自然场景刺激时视网膜功能的逼真计算机模型等，我们有信心能够更好地理解这个大脑微小但极其复杂的组成部分是如何工作的。
