《Redox Biology》：PP4 Modulates Macrophage-Neutrophil Crosstalk to Restrict CCL5 -Driven NETosis in Sepsis
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本研究聚焦脓毒症(sepsis)中先天免疫失调的关键难题。研究人员通过构建髓系细胞特异性PP4基因敲除小鼠，深入探究了PP4（蛋白磷酸酶4）在巨噬细胞与中性粒细胞“对话”中的调控作用。结果首次揭示，PP4缺失会导致巨噬细胞来源的CCL5过度分泌，并通过上调中性粒细胞的CCR5表达，驱动PAD4（肽基精氨酸脱亚胺酶4）依赖的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成、活性氧（ROS）产生及弹性蛋白酶活性，从而加剧脓毒症的炎症和组织损伤。该研究阐明了一个全新的PP4-TBK1/IRF3-CCL5-CCR5-NETosis信号轴，为脓毒症的免疫调节治疗提供了极具潜力的新靶点。
在全球公共卫生领域，脓毒症（Sepsis）一直是重症监护室的噩梦。它是一种由感染引发的、机体免疫系统过度反应，最终导致广泛炎症和多器官衰竭的致命临床综合征，死亡率居高不下。在脓毒症复杂的免疫风暴中，被称为“清道夫”的中性粒细胞本是抵御感染的第一道防线，但当它们过度活化，便会释放出致命的“天罗地网”——中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）。NETs本是捕捉和杀死病原体的武器，但过量产生则会“误伤”健康的组织和细胞，成为推动脓毒症恶化的帮凶。那么，究竟是谁在幕后调控着中性粒细胞的这种“狂暴”行为，使其在抵御外敌时不至于“自毁长城”呢？研究人员将目光投向了免疫细胞之间的“通信”系统。
在免疫细胞复杂的“社交网络”中，巨噬细胞和中性粒细胞的“对话”（crosstalk）对炎症走向至关重要。此前的研究已经发现，在致命的脓毒症患者中，髓系细胞（包括巨噬细胞和中性粒细胞）中的一种名为蛋白磷酸酶4（Protein Phosphatase 4, PP4）的蛋白表达显著降低，暗示它可能扮演着抑制免疫过度反应的“刹车”角色。然而，在脓毒症环境下，PP4具体如何精确调控巨噬细胞和中性粒细胞之间的互动，从而影响NETs的生成，仍然是一个巨大的谜团。为了解开这个谜题，并为开发新的治疗策略提供线索，一篇发表在《Redox Biology》上的研究，深入探索了PP4在脓毒症免疫调控中的核心作用。
为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键技术。首先，他们通过基因工程构建了髓系细胞特异性PP4敲除（PP4myel-KO）小鼠，用以模拟PP4缺失的病理状态。其次，利用经典的盲肠结扎穿刺（CLP）模型和脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症模型来模拟临床脓毒症。在细胞和分子层面，研究采用了多种技术手段：通过单细胞RNA测序（scRNA-Seq）分析公共数据集，挖掘PP4在脓毒症患者免疫细胞中的表达模式与预后的关联；利用免疫印迹（Western Blot）、免疫共沉淀（Co-IP）等技术解析PP4与关键信号分子（如TBK1、ERK1/2）的相互作用及其磷酸化状态；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术（Flow Cytometry）定量检测细胞因子（如CCL5）水平和免疫细胞亚群；最后，采用多种荧光探针和特异性抑制剂，在体外精准评估了中性粒细胞的NETs形成、活性氧（ROS）水平、弹性蛋白酶活性等关键功能指标。
单细胞转录组学分析揭示PP4与脓毒症预后的关联
对公共单细胞测序数据的分析发现，在脓毒症非存活患者的髓系细胞（单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞）中，PP4的表达水平显著低于存活患者和健康对照。这一结果提示，髓系细胞中PP4的低表达可能与脓毒症的致命结局相关，PP4可能成为一个区分预后的潜在生物标志物。
髓系细胞PP4缺失增加脓毒症易感性并加剧炎症
研究人员构建的PP4myel-KO小鼠在经受CLP或LPS攻击后，死亡率显著高于野生型（WT）小鼠。这些小鼠表现出更严重的肝、肺组织损伤，更高的细菌负荷，以及血液中更多的CD11b+白细胞（尤其是中性粒细胞）浸润。血清检测显示，PP4myel-KO小鼠体内促炎细胞因子如IL-6、TNF-α和趋化因子CCL5的水平也急剧升高。这些数据证实，髓系细胞中的PP4对抵抗脓毒症、控制过度炎症至关重要。
CCL5驱动中性粒细胞过度活化与NETosis
研究进一步发现，PP4myel-KO脓毒症小鼠血液中NETs标志物（cfDNA/MPO）水平显著升高。在体外，来自PP4myel-KO小鼠的中性粒细胞在LPS和CCL5的共同刺激下，NETs形成、ROS产生（包括线粒体ROS和总ROS）以及弹性蛋白酶活性均被极大增强。共聚焦显微镜成像直观地显示了CCL5与LPS协同促进NETs的形成。这表明CCL5是驱动中性粒细胞“狂暴”状态的关键因子。
PP4调控PAD4依赖的NETosis
机制探索发现，在PP4myel-KO脓毒症小鼠的肝脏和中性粒细胞中，与NETosis密切相关的蛋白——髓过氧化物酶（MPO）、肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）以及瓜氨酸化组蛋白H3（Cit-H3）的表达均显著上调。使用PAD4特异性抑制剂GSK484预处理，可以有效逆转LPS/CCL5诱导的中性粒细胞NETs形成、ROS产生和弹性蛋白酶活性，证明PP4缺失通过上调PAD4依赖性途径加剧NETosis。
巨噬细胞来源的CCL5是驱动因素
那么，过多的CCL5从何而来？实验证实，PP4myel-KO的巨噬细胞在LPS刺激下会分泌远超正常水平的CCL5。用这些巨噬细胞的培养上清（条件培养基）处理中性粒细胞，会强烈诱导后者发生NETosis和高ROS状态；而如果在培养上清中加入CCL5中和抗体，则能有效阻断这一效应。这明确了巨噬细胞是脓毒症中CCL5过度分泌的重要源头，且其分泌受到PP4的严格调控。
PP4通过去磷酸化TBK1/IRF3抑制巨噬细胞CCL5产生
在分子层面，研究人员揭示了PP4调控巨噬细胞CCL5产生的直接机制。他们发现，PP4缺失的巨噬细胞中，LPS诱导的TANK结合激酶1（TBK1）及其下游转录因子IRF3的磷酸化水平显著增强。免疫共沉淀实验证明，PP4能够直接与磷酸化的TBK1结合。通过小干扰RNA（siRNA）敲低TBK1，或通过腺病毒过表达具有酶活性的野生型PP4（而非磷酸酶活性缺失的突变体），都能有效抑制巨噬细胞CCL5的产生。这表明，PP4通过其磷酸酶活性直接去磷酸化TBK1，从而抑制IRF3活化，最终限制巨噬细胞CCL5的合成。
PP4通过ERK1/2通路调控中性粒细胞CCR5表达
除了控制CCL5的“供应”，PP4还调控着中性粒细胞对CCL5的“接收”能力——即其表面受体CCR5的表达。研究发现，在CLP或LPS刺激后，PP4myel-KO中性粒细胞上的CCR5蛋白表达显著上调。机制研究表明，LPS通过激活细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）通路来上调CCR5，而PP4能与磷酸化的ERK1/2相互作用。使用ERK1/2抑制剂或过表达野生型PP4，都能有效降低CCR5的表达。抑制ERK1/2或CCR5本身，都能显著减轻LPS/CCL5诱导的中性粒细胞NETs形成和弹性蛋白酶活性。
靶向CCL5/CCR5轴可改善脓毒症预后
为了验证该通路的治疗潜力，研究使用了多种干预手段。使用CCR5选择性抑制剂（TAK-779, Maraviroc）或通过siRNA敲低CCR5，都能有效抑制中性粒细胞的过度活化。更重要的是，在动物模型中，CCL5基因敲除（CCL5 KO）小鼠在经受致死性CLP手术后，其生存率显著高于野生型小鼠，同时血清中的NETs水平也大幅降低。这强有力地证明，靶向CCL5/CCR5信号轴是缓解脓毒症病理过程的有效策略。
总结与讨论
该研究系统地描绘了一个在脓毒症中此前未被认识的免疫调控新机制：髓系细胞特异性表达的蛋白磷酸酶4（PP4），作为关键的“免疫稳定器”，通过双重作用抑制中性粒细胞介导的过度炎症和组织损伤。在“信号发送端”（巨噬细胞），PP4通过去磷酸化TBK1，抑制IRF3活化，从而限制促炎趋化因子CCL5的过量产生。在“信号接收端”（中性粒细胞），PP4通过调节ERK1/2的磷酸化状态，限制其表面CCR5受体的异常上调。当PP4功能缺失时，巨噬细胞产生过量的CCL5，而中性粒细胞则高表达CCR5，两者结合后强力激活PAD4依赖的NETosis途径，导致大量ROS产生和NETs释放，最终加剧脓毒症的炎症风暴和多器官损伤。
这项研究的结论具有多重重要意义。首先，它首次将PP4与NETosis及氧化还原（Redox）生物学在脓毒症背景下联系起来，揭示了PP4在维持免疫-氧化还原平衡中的全新功能。其次，研究阐明了巨噬细胞-中性粒细胞互作的一条精细调控通路（PP4-TBK1/IRF3-CCL5-CCR5-NETosis），为理解脓毒症的免疫病理机制提供了更清晰的图谱。最后，也是最关键的一点，该研究指明了PP4本身以及CCL5/CCR5轴作为脓毒症治疗靶点的巨大潜力。通过药物（如CCR5抑制剂、PAD4抑制剂）或基因手段恢复PP4的功能或阻断其下游通路，有望为临床开发出调节先天免疫反应、减轻组织损伤、改善脓毒症预后的新型治疗策略开辟道路。
