《Redox Biology》：Mitochondrial permeability transition pore desensitization by a novel dispiranic derivative prevents cardiac reperfusion injury
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为应对心脏缺血/再灌注损伤中缺乏有效靶向线粒体通透性转换孔(PTP)药理学策略的挑战，研究人员设计并合成了一类新型双螺环小分子。他们通过多学科方法，鉴定出化合物11d能有效且选择性地抑制PTP开放，其通过靶向FO-ATP合成酶的c亚基(Csub)，并在体内外模型中显著减少心肌细胞死亡、改善心脏功能恢复。该研究为心脏再灌注损伤提供了有前景的先导化合物。
心脏疾病是全球范围内的主要死因之一。当心脏的血液供应因阻塞而中断时（即心肌缺血），迅速恢复血流（即再灌注）至关重要。然而，讽刺的是，血流恢复本身有时会造成额外伤害，这被称为心脏缺血/再灌注损伤。造成这种二次伤害的一个关键分子开关是线粒体通透性转换孔。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其外膜一旦通过PTP形成永久性开放通道，就会导致细胞能量崩溃、肿胀甚至死亡。长期以来，找到能精准关闭这个“死亡之门”的药物是心血管领域研究的难点。尽管已知PTP与ATP合成酶的c亚基密切相关，但直接靶向该亚基的药物开发充满挑战，因为抑制它可能会干扰正常的能量生产。因此，发现能选择性地在病理状态下抑制PTP开放，而又不影响线粒体基础功能的化合物，具有重要的临床意义。发表在《Redox Biology》上的一项研究，报道了一类新型的双螺环小分子，为这一难题带来了新的希望。
研究人员运用了多学科交叉的研究策略。关键技术方法包括：化学合成构建了两个系列的双螺环化合物库（基于哌啶酮和吡咯烷支架）；利用钙黄绿素-钴淬灭实验、线粒体肿胀实验评估化合物对活细胞及分离线粒体中PTP开放的抑制作用；通过分子对接和分子动力学模拟预测化合物与ATP合成酶c亚基环的结合模式；使用细胞热位移分析和亚细胞分馏结合质谱验证化合物在细胞内的靶点结合与线粒体定位；利用离体Langendorff大鼠心脏灌流模型评估化合物的心脏保护功能；并通过Seahorse细胞能量代谢分析仪、线粒体膜电位和钙离子检测等多种细胞与分子生物学技术，全面评估化合物的生物活性和潜在毒性。
研究结果
双螺环结构的鉴定与合成作为新型PTP抑制剂：研究人员设计并合成了两类新型双螺环化合物：基于哌啶酮支架和基于吡咯烷支架的化合物。通过两步法或一锅法反应，成功构建了结构复杂的分子库，旨在整合羰基、芳香性、特定空间位阻和杂原子分布等对生物活性至关重要的结构元素。和展示了哌啶酮类化合物的合成路线；和展示了基于异靛红（isatin）的吡咯烷类化合物的合成。
验证双螺环结构作为PTP抑制剂：在人类心室心肌细胞中进行的初步筛选中，化合物11c、11d和12c在1微摩尔浓度下能显著抑制PTP开放，其中11d的抑制率高达约70%。剂量反应实验确定1微摩尔为达到最大抑制效果的最低浓度。在分离的小鼠心脏线粒体肿胀实验中，这3种化合物均能有效抑制钙离子诱导的PTP开放，验证了其体外活性。展示了这些验证数据。
11c、11d和12c对F1FO-ATP酶相关效应的表征：机制研究表明，化合物11d能选择性抑制由钙离子（Ca2+）激活的F1FO-ATP酶水解活性（该活性与PTP调节相关），而对镁离子（Mg2+）激活的ATP合成活性无影响。动力学分析表明11d是一种非竞争性抑制剂。相互排除分析提示其结合位点可能与已知的FO抑制剂寡霉素（Oligomycin A）和DCCD（二环己基碳二亚胺）的位点部分重叠但又不完全相同。展示了这些酶学实验结果。
双螺吡咯烷衍生物在常氧条件下的生物学表征：在正常培养条件下，化合物11d和12c对心肌细胞的线粒体呼吸、膜电位、钙离子摄取、线粒体网络形态以及细胞活力均无显著不良影响，显示出良好的生物相容性。而化合物11c对ATP产生和线粒体膜电位有轻微影响。展示了这些安全性评估数据。
11d和12c在心肌细胞缺氧/复氧后的细胞保护作用：在模拟缺血/再灌注的缺氧/复氧模型中，11d和12c能显著减轻复氧时PTP的开放（抑制率分别为55%和29%），减少细胞死亡（包括凋亡和坏死），并提高细胞存活率。重要的是，11d还能显著降低缺氧/复氧诱导的线粒体活性氧（ROS）产生，并轻微但显著地调节线粒体钙离子超载。展示了这些细胞保护数据。
双螺吡咯烷衍生物在猪主动脉内皮细胞缺氧/复氧后的细胞保护作用：在猪主动脉内皮细胞模型中，化合物11d和12c不影响细胞的基础能量代谢。在缺氧/复氧损伤后，11d能有效恢复细胞活力，并挽救因损伤而受损的线粒体呼吸功能，特别是最大呼吸能力和ATP产量。展示了这些内皮细胞保护数据。
11d和12c在心脏再灌注损伤模型中的心脏保护作用：在离体Langendorff大鼠心脏缺血/再灌注模型中，于再灌注期给予11d或12c（10微摩尔），能显著改善心脏功能恢复，提高左心室发展压，降低舒张末压。组织学分析显示，这两种化合物能显著减少心肌细胞凋亡，并更好地保存心肌组织的结构完整性。展示了这些离体心脏实验结果。
11d和12c通过与c亚基相互作用发挥PTP抑制作用：分子对接与分子动力学模拟表明，11d和12c能稳定地结合在人源ATP合成酶c亚基环的经典寡霉素结合口袋内。11d的结合模式与寡霉素更为相似，而12c的结合构象则有所偏移。实验验证显示，11d能特异性地在线粒体中富集，并通过细胞热位移分析证实其能与ATP合成酶c亚基蛋白发生直接相互作用，导致该蛋白的热稳定性增加。和分别展示了计算模拟和实验验证的结果。
研究结论与讨论
本研究成功设计、合成并表征了一类新型的双螺环小分子化合物，其中化合物11d被鉴定为一种强效、选择性的线粒体通透性转换孔脱敏剂。其核心机制在于选择性抑制钙离子激活的F1FO-ATP酶活性，而不影响镁离子依赖的ATP合成，从而在不破坏基础能量代谢的前提下，精准干预病理性的PTP开放。分子模拟和实验证据共同支持11d通过结合ATP合成酶c亚基发挥作用。
在功能上，11d在细胞和器官水平均表现出显著的保护作用：它能减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞和内皮细胞死亡，抑制线粒体活性氧爆发，并在离体大鼠心脏模型中显著改善再灌注后的心脏功能、减少梗死相关细胞死亡、保护心肌结构。这些效果优于此前报道的已知PTP抑制剂。
该研究的重大意义在于，它首次报道了一类基于全新双螺环骨架的PTP抑制剂，并明确了其通过靶向ATP合成酶c亚基发挥作用的分子机制。化合物11d不仅证明了靶向c亚基是治疗再灌注损伤的可行策略，更因其高效力和良好的安全性，成为一个极具转化潜力的先导化合物。这项工作为开发针对心肌梗死等缺血性心脏病再灌注损伤的新型心脏保护药物提供了重要的分子基础和候选药物。
