《Reproductive BioMedicine Online》：Investigating DNA contamination affecting embryo biopsy specimens taken for PGT-A: Incidence and impact on the accuracy of chromosomal analysis
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胚胎活检DNA污染对PGT-A结果的影响研究。通过分析57,292例PGT-A样本，发现0.45%的样本存在DNA污染，不同诊所污染率差异显著（P<0.0001）。污染可能导致44.5%的胚胎染色体状态误判，包括将健康胚胎误判为异常。研究证实含SNP分型的PGT-A方法能有效检测污染，建议将污染率作为临床质控关键指标。
乔治娜·克拉克（Georgina Clark）| 杜鲁蒂·巴巴里亚（Dhruti Babariya）| 梅德利·基尔比（Medley Kilbee）| 埃莱娜·费尔南德斯·马科斯（Elena Fernández Marcos）| 艾曼·哈吉·阿里（Ayman Haj Ali）| 瓦西莱·切班（Vasile Ceban）| 安东尼奥·卡帕尔博（Antonio Capalbo）| D. 韦尔斯（D. Wells）
英国牛津Juno Genetics公司
摘要
研究问题
用于植入前遗传检测（PGT-A）的胚胎活检样本中DNA污染的普遍程度是多少？这种污染多久可能导致结果解读错误？
研究设计
本研究回顾了来自32家试管婴儿诊所的57,292份临床PGT-A样本，以确定影响滋养层活检样本的DNA污染频率。所使用的检测方法经过了严格验证，并被广泛采用，能够检测超过4000个单核苷酸多态性（SNP）。
结果
验证实验确认了该方法能够可靠地检测出DNA污染。总体而言，0.45%（256/57,292）的滋养层活检样本存在污染，但不同诊所之间的污染率存在显著差异（P<0.0001，卡方检验）。155个活检样本受到污染的胚胎通过第二个（未受污染的）样本得到了正确的检测结果。对比这两个样本后发现，如果未检测到污染，44.5%（69/155）的胚胎在染色体状态分类上可能会出现错误。
结论
DNA污染影响了1/222的样本。然而，某些诊所的污染率低于千分之一，而其他诊所的污染率则高出十倍以上。污染与诊断错误的风险显著相关，可能导致可存活胚胎被丢弃或将非整倍体胚胎移植到子宫内。我们建议使用能够检测DNA污染的经过验证的PGT-A方法，并将污染率作为提供PGT-A服务的诊所的关键绩效指标。
引言
人类植入前胚胎中非整倍体现象较为常见，且随着母亲年龄的增长而增加（Hassold等人，1980年；Harton等人，2013年；Franasiak等人，2014年；Konstantinidis等人，2020年）。已知减数分裂异常与胚胎着床失败、妊娠丢失或罕见的持续非整倍体妊娠有关（Menasha等人，2005年；Scott等人，2012年；Tiegs等人，2021年；Capalbo等人，2022年）。从试管婴儿周期中识别出染色体正常的胚胎并优先将其移植到子宫内，可以为患者带来多种益处，包括提高每次胚胎移植的妊娠率和降低流产风险（Munne等人，2017年；Rubio等人，2017年；Neal等人，2018年；Ozgur等人，2019年；Morales，2024年）。这一理念促进了多种检测植入前胚胎细胞染色体拷贝数异常方法的发展和应用，这一过程被称为植入前遗传检测（PGT-A）。近年来，PGT-A的使用率迅速增加，目前美国超过一半的试管婴儿周期都包含某种形式的染色体评估（Roche等人，2021年；Hipp等人，2022年）。
在过去三十年中，PGT-A的方法经历了显著发展，从20世纪90年代初使用的荧光原位杂交（FISH）（Munné等人，1993年；Munné等人，1995年），发展到中期比较基因组杂交（CGH）（Voullaire等人，1999年；Wells等人，1999年；Wells和Levy，2003年），微阵列CGH（aCGH）（Vanneste等人，2009年；Fragouli等人，2010年；Alfarawati等人，2011年；Gutiérrez-Mateo等人，2011年），单核苷酸多态性微阵列（Schoolcraft等人，2011年），定量PCR（Treff等人，2012年），以及最新的下一代测序（NGS）（Wells等人，2014年）。如今，NGS在PGT-A领域占据主导地位，其通量更高且成本更低。此外，NGS的更高灵敏度使得能够检测到滋养层活检中的细微染色体拷贝数变化，其中一些变化可能与滋养层活检样本中的染色体嵌合现象有关（Goodrich等人，2016年；Ruttanajit等人，2016年；Munné和Wells，2017年）。
许多PGT实验室使用商业化的试剂盒和软件来指示滋养层活检样本中的染色体拷贝数相对比例，这些方法基本上采用了“低通量”基因组测序策略，类似于十多年前首次报道的基于NGS的PGT方法。这种方法通常包括全基因组扩增（WGA），然后对产生的DNA片段进行测序。通过分析这些DNA片段的序列，可以确定它们来自哪些染色体。如果胚胎活检样本的分析显示某个染色体的DNA片段数量明显多于正常整倍体样本，就可以推断该染色体存在额外的拷贝；而片段数量较少则可能表明染色体丢失（Wells等人，2014年）。
最近开发的NGS方法除了评估每个染色体的DNA相对含量外，还提供了单核苷酸多态性（SNP）的基因型信息，这些SNP存在于某些测序的DNA片段中（Marin等人，2018年；Kim等人，2022a；Buldo-Licciardi等人，2023年）。在染色体正常的样本中，部分SNP将是纯合的（例如AA或BB），此时覆盖该多态性位点的所有测序DNA片段将包含相同的等位基因。其他SNP将是杂合的（AB），每种等位基因的DNA片段数量大致相等。但如果发生了染色体丢失（例如单体性或单倍体），受影响染色体上的所有SNP将呈现纯合状态。相反，如果染色体发生了增加（例如三体性或三倍体），则会检测到杂合SNP，但每种等位基因的DNA片段比例将不相等（表明基因型为AAB或ABB）（Kim等人，2022a）。这种方法的优势在于它可以检测出仅通过检测染色体相对DNA含量无法发现的异常，如单倍体（23,X）、三倍体（包括69,XXX）和某些形式的单亲性非整倍体）。
最早的基于NGS的方法之一是haplarithmisis，该方法旨在推断位于同一染色体拷贝上的连锁多态性块（haplotypes）。该技术结合了单个染色体上DNA量的定量数据和不同亲本haplotypes的数量分析，以实现准确的非整倍体检测（Esteki等人，2015年；Dimitriadou等人，2017年；Janssen等人，2024年）。尽管haplarithmisis可用于PGT-A，但目前只有少数实验室采用这项技术。值得注意的是，基于微阵列而非NGS的karyomapping技术也能提供亲本haplotypes的分析，通过检测基因组中的约300,000个SNP来实现。然而，karyomapping需要来自父母和胚胎的DNA样本，成本高于大多数PGT-A方法，并且缺乏系统验证其非整倍体检测能力的公开数据。因此，karyomapping主要用于单基因疾病的植入前遗传检测（PGT-M）（Handyside等人，2010年；Kim等人，2022b；Schadwell等人，2022年）。
检测大量SNP的PGT方法还有一个优势，即它们有可能检测到DNA污染物，因为来自多个个体的遗传物质会导致所有染色体上等位基因比例的特征性变化（van Dijk等人，2022年）。在进行PGT-M时，污染一直被视为一个严重问题，已经采用了多种策略来检测污染（例如使用SNP微阵列或微卫星多态性进行DNA指纹分析，或使用阴性对照）（Konstantinidis等人，2014年；Piyamongkol等人，2022年）。然而，在临床PGT-A过程中，人们对胚胎活检样本可能被污染的可能性关注较少，且一些诊所的污染预防措施也比PGT-M更为宽松。使用简单的低通量NGS方法无法检测到污染，因为样本管中的所有DNA（无论是来自胚胎还是污染物）都会被一起检测，无法区分。阴性对照通常由洗涤胚胎活检样本的缓冲液最终滴液中的少量液体组成，在PGT-A过程中很少使用。即使分析了阴性对照，也无法评估实际含有活检样本的试管内容物，因此可能存在阴性对照不含外来DNA而样本本身被污染的情况（反之亦然）。关于PGT-A样本中DNA污染的发生率及其对胚胎预测遗传状态的影响，目前研究较少。
本研究的目标如下：1）验证一种广泛使用的PGT-A方法检测DNA污染的能力；2）确定用于PGT-A的胚胎活检样本中存在DNA污染的比例；3）评估污染对PGT-A结果分类（即整倍体、非整倍体、三倍体、中间拷贝数/嵌合体）的影响，并考虑这种污染对仅依赖染色体拷贝数测量而不同时评估SNP基因型的PGT-A方法的潜在临床影响。
方法验证
本研究使用了PGTseq方法，这是一种经过严格验证的PGT方法，包括对基因组中数千个位点的靶向扩增，随后进行基于NGS的染色体拷贝数评估，并分析测序DNA片段中的多个SNP。先前研究表明，该方法在筛查胚胎染色体异常时能够获得高度一致的结果，来自同一胚胎的两个滋养层活检样本之间的吻合度约为99%
污染检测的验证
模拟精确污染DNA量的实验结果表明，PGTseq平台能够准确检测到占总DNA量20-80%范围内的污染。在这个范围内，污染DNA会导致SNP基因分型结果的明显变化。研究发现，高水平的污染（>80%）可能导致完全无法检测到染色体异常
讨论
自从PGT-A停止使用荧光原位杂交（FISH）并开始采用基于DNA扩增的方法以来，DNA污染就有可能影响检测结果。对于qPCR、CGH、arrayCGH和“低通量”NGS等方法来说，常规操作中很难甚至无法检测到污染。尽管外来DNA的污染可能会影响PGT-A的结果，导致严重错误，但这一问题一直被忽视
参考文献
Alfarawati, S., Fragouli, E., Colls, P. & Wells, D. 2011. 使用比较基因组杂交和微阵列分析对结构染色体异常进行植入前遗传诊断后的首胎出生。Hum Reprod, 26, 1560-74.
Buldo-Licciardi, J., Large, M. J., Mcculloh, D. H., Mccaffrey, C. & Grifo, J. A. 2023. 利用人工智能（AI）技术进行标准化植入前遗传检测（PGT-A）与改善妊娠结果相关
利益冲突声明
所有作者均为Juno Genetics公司的员工，该公司是一家生殖遗传服务提供商。
乔治娜·克拉克拥有产前遗传学和胎儿医学硕士学位，目前担任牛津Juno Genetics公司的实验室经理。她正在牛津大学攻读妇女与生殖健康方向的博士学位。
一种经过验证的PGT-A方法，包括单核苷酸多态性的基因分型，使我们能够评估超过57,000份样本中胚胎活检样本的污染频率及其对诊断结果的影响
