《Particle & Particle Systems Characterization》：Theranostic Nanoparticles for Fluorosensitive Visualization and Inhibition of Amyloid Beta-Induced Neuroinflammation
1 引言
阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease, AD）是最常见的痴呆症形式，是一种进行性神经退行性疾病。其特征是β-淀粉样蛋白（amyloid-beta, Aβ）斑块的积聚、tau蛋白病理和慢性神经炎症。尽管研究广泛，开发能够改变疾病进程的疗法仍然面临重大挑战，这主要源于致病蛋白聚集、受损的清除机制和持续的小胶质细胞（大脑常驻免疫细胞）激活之间的复杂相互作用。小胶质细胞功能失调不仅会加剧Aβ积聚，还会通过释放促炎细胞因子和氧化物质导致突触丧失和神经元损伤。因此，能够调节小胶质细胞行为和增强Aβ清除的策略为治疗干预带来了巨大希望。
近年来，我们报道了通过酯化糖基二酸（特别是黏酸和酒石酸）合成两亲性大分子（amphiphilic macromolecules, AMs）的方法。这些糖与疏水脂肪链偶联，然后与亲水的聚乙二醇（poly (ethylene glycol), PEG）偶联，形成的结构展现出生物稳定性和受体亲和力。我们的AM纳米颗粒（AM–NPs）能够阻断Aβ纤维化，减少对前纤维状Aβ的摄取，降低炎症，增强降解，并保护神经元免受神经毒性。然而，有效治疗的主要障碍之一是大多数治疗剂穿越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）并进入脑组织的能力有限。此外，许多现有方法在靶向特定细胞区室内的病理过程方面缺乏特异性。我们基于纳米技术的药物递送平台为解决这些局限性提供了有希望的解决方案，通过增强脑渗透、改善细胞靶向和实现治疗分布的实时成像。
在这篇手稿中，“诊疗一体化”一词用于描述一个细胞水平的、概念验证平台，该平台将治疗活性与基于荧光的细胞内可视化相结合。为了便于实时细胞追踪和成像，我们使用碳二亚胺介导的偶联化学将罗丹明-B荧光团共价连接到AM聚合物主链上。这个荧光标签允许直接观察聚合物摄取、细胞内分布，以及与淀粉样蛋白聚集体和溶酶体标记物在小胶质细胞中的共定位。罗丹明-B标记的AMs通过闪速纳米沉淀进一步配制为纳米颗粒（Rh-AM-NPs），产生具有可控尺寸和表面性质的稳定、单分散纳米结构。在本研究中，我们提出了一个基于AMs的转化纳米技术平台，该平台被设计用于与参与Aβ摄取和降解的小胶质细胞清道夫受体相互作用。
2 材料与方法
2.1 Rh-AMs的合成
所有试剂和溶剂均购自Sigma–Aldrich、TCI Chemicals或Fisher Scientific，除非另有说明，否则未经进一步纯化即使用。黏酸、酒石酸、月桂酰氯、聚乙二醇（PEG, Mw = 5000 Da）和罗丹明B被用作合成两亲性大分子的前体。碳二亚胺偶联试剂，包括EDC、DCC、NHS和DPTS，用于偶联反应。
2.2 Rh-PEG (1)的合成
在一个含有搅拌棒的圆底烧瓶中，先在真空下火焰干燥，然后用氩气填充。将NHS (0.12 mmol, 14 mg)、EDC (0.12 mmol, 23 mg)和Mw为5000 g/mol的OH-PEG-COOH (0.1 mmol, 500 mg)溶解在3 mL干燥的CH2Cl2中。在第二个同样经火焰干燥并用氩气填充的反应瓶中，将DMAP (0.05 mmol, 6 mg)和罗丹明B (0.1 mmol, 48 mg)在2 mL干燥CH2Cl2中的溶液逐滴加入第一个烧瓶。在氩气氛下回流24小时后，所得混合物用10 mL 0.5 N HCl、饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液洗涤。有机相用无水Na2SO4干燥，然后蒸发溶剂。粗产物通过快速柱层析法，使用1:9的MeOH/CH2Cl2混合物进行纯化。通过减压蒸发溶剂收集纯产物（产率=61%）。
2.3 Rh-PEG-b-PLA (2)的合成
将PEG(5000)-b-PLA(1000) (3.0 g, 1.0 mmol)、罗丹明B (580 mg, 1.1 mmol)和DPTS (0.18 g, 1.0 mmol)在室温下加入二氯甲烷(30 mL)中。还加入DMF (3.0 mL)以确保形成清澈、均质的溶液。在氮气下10分钟后，在15分钟内逐滴加入2.0 mL DCC溶液（在二氯甲烷中，1.0 M）。24小时后，反应混合物用20 mL份的盐水（5次）洗涤，用无水硫酸钠干燥，并蒸发至干。粗产物通过从二氯甲烷(5 mL)中沉淀到乙醚(100 mL)中进行纯化。产物为红色蜡状固体(2.6 g, 产率82%)。
2.4 T12和M12的合成
将黏酸或酒石酸(4.2 g, 20 mmol)和氯化锌(0.28 g, 2.0 mmol)加入月桂酰氯(37 mL, 160 mmol)中。将反应混合物加热至90°C，持续10–12小时。冷却至室温后，向反应混合物中加入乙醚(20 mL)，并将混合物搅拌到冰水（约150 mL）中。向混合物中加入额外的乙醚(80 mL)，并继续搅拌30分钟。分离乙醚部分，用盐水洗涤至中性pH（约7），用无水硫酸钠干燥，并蒸发至干。粗产物通过从乙醚(20 mL)中沉淀到石油醚(200 mL)中进行纯化。产物为白色粉末(13 g，产率68%)。
2.5 Rh-T12P5的合成
将Rh-PEG (4.0 g, 1.0 mmol)、T12(2.2 g, 3.0 mmol)和DPTS (0.2 g, 1.0 mmol)在室温下加入二氯甲烷(30 mL)中。还加入DMF (3.0 mL)以确保形成清澈、均质的溶液。在氮气下10分钟后，在15分钟内逐滴加入3.0 mL DCC溶液（在二氯甲烷中，1.0 M）。48小时后，反应混合物用20 mL份的盐水（5次）洗涤，用无水硫酸钠干燥，并蒸发至干。粗产物通过从二氯甲烷(5 mL)中沉淀到乙醚(100 mL)中进行纯化。产物为红色蜡状固体(3.7 g，产率85%)。
2.6 Rh-M12P5的合成
将Rh-PEG (4.0 g, 1.0 mmol)、M12(3 g, 3.0 mmol)和DPTS (0.3 g, 1.0 mmol)在室温下加入二氯甲烷(30 mL)中。还加入DMF (3.0 mL)以确保形成清澈、均质的溶液。在氮气下10分钟后，在15分钟内逐滴加入3.4 mL DCC溶液（在二氯甲烷中，1.0 M）。48小时后，反应混合物用20 mL份的盐水（5次）洗涤，用无水硫酸钠干燥，并蒸发至干。粗产物通过从二氯甲烷(5 mL)中沉淀到乙醚(100 mL)中进行纯化。产物为红色蜡状固体(3.0 g，产率76%)。
2.7 Rh-AMs的表征
产物的核磁共振（1H和13C NMR）谱使用Bruker Avance NEO 600 MHz分光光度计获得。样品溶解在氘代氯仿中。傅里叶变换红外（FT-IR）谱在Thermo iS 10 FT-IR光谱仪上记录，使用OMNI软件作为32次扫描的平均值。紫外-可见吸收光谱数据使用UV?vis分光光度计（HP 8453）获得。熔融温度通过DSC测定：DSC: Netzsch DSC 214 Polyma 和 TGA: Netzsch TG 209 F1 Libra。
2.8 通过闪速纳米沉淀制备纳米颗粒
罗丹明标记的纳米颗粒（Rh-AM-NPs）使用闪速纳米沉淀技术通过受限撞击射流混合器合成。简要地说，有机相的制备首先是将6 mg/mL原始的两亲性壳分子溶解在125 μL四氢呋喃中。然后将该溶液与2 mg/mL罗丹明偶联的壳分子结合，得到最终250 μL的有机相流，其中包含8 mg/mL总壳（6 mg/mL未标记AMs + 2 mg/mL罗丹明标记）和2.5 mg/mL的疏水核心分子。该有机相流使用CIJ混合器与250 μL的水相流撞击，混合时间受控，以确保纳米颗粒形成时间超过混合时间，从而促进均匀的纳米颗粒尺寸分布。所得纳米颗粒悬浮液立即稀释到9倍体积的超纯水中以终止进一步聚集并增强稳定性。然后使用3.5 kDa MWCO透析盒将纳米颗粒对水进行透析，以去除残留溶剂和未掺入的物质。使用马尔文Zetasizer Nano ZS90进行动态光散射以确定Rh-NPs的水合半径和多分散指数。
3 纳米颗粒表征
3.1 动态光散射和Zeta电位测量
使用马尔文仪器公司的NanoZS90仪器测量动态光散射、Zeta电位和多分散指数。测量前，样品溶解在去离子水中。每个样品进行三次分析，每次运行在25°C下进行30次测量。
3.2 透射电子显微镜
对于纳米颗粒成像，将NPs加载到涂有Formvar膜、碳稳定的400目铜网上。用Whatman滤纸去除多余溶液，然后直接成像纳米颗粒。图像在80 kV电压下以22,000倍放大倍率拍摄。
3.3 荧光光谱
在激发波长为530 nm的Horiba PTI QM-400荧光分光光度计上测量Rh-NPs的荧光光谱，激发和发射的狭缝宽度均固定在1.5 nm。发射光谱记录范围为535至750 nm。
3.4 Aβ1–42纤维的制备和表征
Aβ1–42纤维按照先前报道的协议制备。简要地说，首先将Aβ1–42肽溶解在100% 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中，最终浓度为5 mg/mL，分装，然后在通风橱中室温下空气干燥过夜。将干燥的肽在DMSO中复溶至终浓度为5 mM，并在低吸附微量离心管中超声处理1分钟。然后将肽溶液在含有0.2%十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲盐水中稀释至200 μM，并在37°C下孵育至少4周，以300 rpm的恒定速度振荡以促进纤维形成。通过离心在4°C下以5000×g收集纤维1小时。通过测量280 nm处的吸光度确定Aβ纤维的浓度，使用消光系数为1280 M-1cm-1。通过硫磺素T荧光测定和透射电子显微镜确认纤维形成。
4 细胞培养
4.1 BV2小鼠小胶质细胞系
BV2小胶质细胞由Dr. Bin Liu和Dr. Jason Richardson惠赠。细胞在补充了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜氏改良Eagle培养基中培养。对于实验，将BV2细胞以每孔20,000个细胞的密度接种在96孔板中，并让其贴壁24小时。所有后续处理均在补充了1% FBS和1% Pen/Strep的DMEM中进行，以最大限度地减少基础激活，同时维持细胞活力。
4.2 细胞毒性测定
为了评估Rh-NPs的细胞相容性，通过测量乳酸脱氢酶释放进行细胞毒性测定。简要地说，将BV2小胶质细胞以每孔20,000个细胞的密度接种在96孔板中，并用具有不同Rh-AMs成分（0.5, 1, 2 mg）的Rh-NPs连续稀释液处理24小时，然后收集50 μL培养基。然后通过使用Tecan Infinite M200 Pro酶标仪在490 nm处评估红色甲臜产物的吸光度来测量释放的LDH水平。数据被归一化到最大LDH释放对照。
4.3 BV2小胶质细胞激活和细胞因子测定
将BV2细胞以每孔20,000个细胞的密度接种在96孔板中，并让其贴壁过夜。然后用20 μM fAβ在有或无纳米颗粒的情况下共处理细胞，或以10 ng/mL脂多糖作为阳性对照。处理24小时后，收集培养上清液，并使用Griess试剂测定测量一氧化氮的产生。收集上清液后，用4%多聚甲醛固定细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并进行免疫细胞化学测定。
4.4 免疫细胞化学
铺板后，细胞用4%多聚甲醛固定，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并在室温下加入PBS-T渗透10分钟。然后用磷酸盐缓冲盐水再次洗涤细胞，然后与2%山羊封闭缓冲液孵育1小时，以减少非特异性抗体结合和背景噪音。然后将细胞在4°C下与一抗（抗-iNOS抗体，1:200）孵育过夜。第二天，细胞进行第二次渗透步骤，然后在室温下与Alexa 488偶联的二抗孵育1小时。细胞也用Hoechst复染，然后使用Keyence BZ-X810显微镜成像。
5 结果
5.1 罗丹明B标记的AM–NPs的合成和物理化学表征
两亲性大分子Rh-T12P5和Rh-M12P5通过糖基二酸的酯化和聚乙二醇化，然后使用碳二亚胺介导的偶联进行罗丹明-B偶联，成功合成。通过1H核磁共振、红外、紫外-可见和荧光光谱确认了罗丹明-B的成功掺入，这些光谱显示出适合生物成像应用的独特吸收和发射特性。罗丹明标记的AMs通过闪速纳米沉淀自组装成纳米颗粒，产生稳定、单分散的纳米结构。动态光散射测量显示Rh-T12P5-NPs的水合直径为125 ± 11 nm，Rh-M12P5-NPs为142 ± 9 nm，Rh-PEG-b-PLA NPs为112 ± 16 nm。所有配方均表现出低多分散指数（PDI < 0.12），表明颗粒群体均匀，并保持负Zeta电位（-19.9至-27.3 mV），表明胶体稳定性良好。透射电子显微镜确认了纳米颗粒的球形形态，而荧光光谱显示所有Rh-AM–NP配方都具有强大的罗丹明发射。这些发现证实了具有理想物理化学性质的可追踪Rh-AM-NPs的有效配方，适用于生物学应用。
5.2 Rh-AM–NPs的细胞毒性和细胞摄取
为了评估新开发的Rh-AM-NPs的细胞毒性范围和生物相容性，考虑到据报道高浓度罗丹明具有毒性，使用BV2细胞评估了Rh-AM-NPs的细胞毒性效应。将BV2细胞与含有不同量Rh-AM（1、0.5和0.1 mg）的Rh-AM-NPs连续稀释液孵育24小时。然后测量从BV2细胞释放的LDH水平并归一化到最大LDH释放对照。所有Rh-AM-NPs都表现出较低的细胞毒性范围（<20%），除了那些具有高Rh-AMs含量和高浓度范围（0.16和0.08 mg/mL）的NP。有趣的是，高浓度范围（0.16和0.08 mg/ml）的Rh-AM-NPs细胞毒性未超过40%。接下来，我们研究了Rh-AM-NPs被BV2细胞实时内化的能力。为了测试这一点，将BV2细胞与Rh-AM-NPs孵育，然后在不同时间点（5、15、60、120、180和1440分钟）用4%多聚甲醛固定。然后，用Hoechst复染细胞，并在564 nm处成像以观察细胞内Rh-AM-NPs。三种Rh-AM-NPs在24小时内均表现出稳健的、逐渐的细胞内化，其中Rh-T12P5在BV2细胞中显示出最快的饱和，尤其是在较早的时间点。
5.3 Rh-AM-NPs中断fAβ内化并调节小胶质细胞炎症反应
阿尔茨海默病与促炎性小胶质细胞激活和小胶质细胞表型转变有关。为了评估Rh-AM-NPs调节fAβ诱导的小胶质细胞炎症反应的能力，我们测量了亚硝酸盐的释放和小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶的表达，这直接反映了iNOS介导的炎症通路的激活。用20 μM fAβ在有或无不同Rh-AM含量（0.5、1和2 mg）的Rh-AM-NPs的情况下共处理BV2细胞，或以10 ng/mL脂多糖作为阳性对照。在较低的Rh-AM含量（0.5和1 mg）下，与仅fAβ的对照组相比，Rh-T12P5和Rh-M12P5均显著降低了亚硝酸盐释放和iNOS表达。同样，未标记的NPs处理的细胞显示没有可检测到的亚硝酸盐释放和没有iNOS表达。然而，在测试的最高Rh-AM含量（2 mg）下，Rh-M12P5未能抑制炎症，如显著升高的iNOS表达所证明。值得注意的是，即使在最高的Rh-AM含量（2 mg）下，Rh-T12P5也保持了其抗炎作用，iNOS表达降低到与仅用载体对照组相当的水平，无论剂量如何。相比之下，对照Rh-PEG-b-PLA在任何测试浓度下均未显示出亚硝酸盐释放和iNOS表达的显著降低。通常，罗丹明标记的AMs在空间上比酒石酸或黏酸基AMs更大。这种增加的体积可能会影响纳米颗粒的堆积和壳的组织，可能会影响立体化学更复杂的黏酸衍生的AMs，并且可以解释这些Rh-NPs中较高罗丹明含量下生物活性的差异。
接下来，鉴于我们之前的发现证明了AMs在抑制小胶质细胞fAβ内化方面的功效，我们研究了AMs壳的Rh偶联对此功能的影响。为了测试这一点，我们采用了BV2小胶质细胞的fAβ介导的炎症模型。BV2细胞在Rh-AM-NPs处理的细胞中测量了细胞内fAβ的免疫反应性，并与仅fAβ处理的细胞进行比较。与仅fAβ的对照组相比，Rh-T12P5和Rh-M12P5均显著降低了细胞内fAβ。这种fAβ的减少证实了生物活性Rh-AMs中断fAβ运输的能力未受影响。这一发现得到了对照Rh-PEG-b-PLA的证实，与仅fAβ的对照组相比，它未对细胞内fAβ水平产生任何改变。同样，与用fAβ和未标记的对照NPs处理的细胞相比，未标记的NPs处理的细胞显示出显著降低的细胞内fAβ。
6 讨论
在这项研究中，我们假设Rh-AMs可以形成稳定、功能的纳米颗粒，作为一种诊疗多模式方法，提供追踪疾病分子细节的潜力，同时靶向其炎症成分。诊疗纳米颗粒通常定义为那些将治疗与疾病状态传感相结合的物质。相比之下，Rh-AM-NPs作为成像支持的治疗剂和细胞水平的诊疗原型，其诊断功能仅限于体外基于荧光的细胞内追踪。这种区分明确了它们的范围，同时强调了细胞成像对于机制研究的价值。
我们之前的研究报道了SR特异性的AM-NPs作为有效的纳米治疗剂，可以靶向疾病的多个方面，包括细胞外纤维淀粉样蛋白β的形成和BV2细胞内的内化。本研究为新型NPs的功效和适用性提供了概念验证，这些NPs由精确组合的Rh标记和未标记AMs组成。
几种罗丹明荧光团已被广泛用于通过标记配方来追踪NPs的内化。然而，细胞毒性潜力因NPs的组成、功能化、剂量和细胞类型而异。最近，一项利用罗丹明衍生物与没食子酸基纳米颗粒协同作用的研究表明，这些NPs在体外和体内都能有效地靶向fAβ相关病理。
罗丹明标记的AMs以各种浓度（2、1、0.5和0.1 mg/mL）使用，其中0.5 mg/mL用于NPs的制备。一项研究报告称，罗丹明B的安全浓度被认为高达1 mg/mL，尽管没有FDA批准的参考来支持这一说法。尽管如此，我们选择了0.5 mg/mL的浓度，该浓度在安全范围内，远低于毒性水平。这些纳米颗粒在BV2细胞中表现出相当的物理性质和最小的毒性，形成被小胶质细胞内化的功能性结构，并对fAβ诱导的炎症发挥强大的抗炎作用。尽管Rh-NPs表现出良好的小胶质细胞调节能力，但它们穿越血脑屏障的能力是一个关键参数，需要在复杂的生理模型中进行进一步研究。
7 结论
总之，本研究报道了罗丹明标记的两亲性大分子基纳米颗粒的开发，作为一种细胞水平的诊疗原型，用于阿尔茨海默病中靶向调节和成像小胶质细胞反应。这些纳米颗粒由糖基二酸合成，并经过脂肪链、PEG臂和罗丹明-B标签功能化，形成了与小胶质细胞清道夫受体相互作用的稳定、单分散结构。表征揭示了良好的尺寸、表面电荷和荧光。体外测定显示出高生物相容性、特异性靶向和有效的细胞摄取。Rh-AM–NPs显著降低了Aβ诱导的小胶质细胞炎症，并增强了与Aβ聚集体的溶酶体共定位，突出了它们恢复小胶质细胞清除功能的潜力。
通过将结构生物活性与荧光成像相结合，该平台既能够进行机制研究，又能够进行治疗干预，将Rh-AM–NPs定位为应对阿尔茨海默病神经炎症和淀粉样蛋白病理的有前途的工具，并为中枢神经系统疾病的未来诊疗一体化策略铺平了道路。
未来的研究将需要探索具有特定表面性质的罗丹明标记纳米颗粒在使用适当的体内模型转移fAβ清除方面的作用。这将涉及精确靶向清道夫受体和调节小胶质细胞表型。
