《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Raman-guided analysis of drug response combined with chemometrics helps monitor the effect of ruxolitinib on acute lymphoblastic leukemia
编辑推荐：
拉曼光谱联合化学计量学分析显示RUX通过抑制JAK2-STAT5通路在B-ALL突变细胞中引发特异性生化改变，未影响野生型细胞。
阿德里亚娜·亚当奇克（Adriana Adamczyk）|尤斯蒂娜·雅库博夫斯卡（Justyna Jakubowska）|玛尔塔·谢夫奇克（Marta Szewczyk）|安娜·M·诺瓦科夫斯卡（Anna M. Nowakowska）|卡茨珀·斯塔沃斯基（Kacper Stawoski）|阿加塔·帕斯托尔查克（Agata Pastorczak）|沃伊切赫·姆林纳尔斯基（Wojciech M?ynarski）|马尔戈扎塔·巴拉恩斯卡（Ma?gorzata Baranska）|金加·奥斯特罗夫斯卡（Kinga Ostrowska）|卡塔琳娜·马伊兹纳（Katarzyna Majzner）
雅盖隆大学化学系，波兰克拉科夫格罗诺斯塔约瓦街2号（2 Gronostajowa St.），邮编30-387
摘要
鲁索利替尼（Ruxolitinib，简称RUX）是一种选择性JAK1/JAK2抑制剂，被用作治疗具有JAK2功能获得性突变的儿童B细胞前体急性淋巴细胞白血病（B–ALL）的候选药物。本研究旨在评估拉曼光谱结合化学计量分析是否能够监测RUX治疗对B–ALL细胞系的生化效应。我们采用了单细胞共聚焦拉曼成像、流式细胞术和Western blotting技术，来观察JAK2突变细胞（MUTZ–5和MHH–CALL–4）及野生型（SEM）B–ALL细胞在10 μM RUX作用下48小时内的反应。通过降维方法（PCA、t-SNE）和分类方法（o-PLS-DA）对光谱数据进行处理，以识别治疗引起的变化。结果显示，RUX能够选择性地降低STAT5的磷酸化水平，并在JAK2突变细胞中引起特定的拉曼光谱位移，尤其是在与DNA和蛋白质相关的谱带中。而在JAK2野生型细胞中未观察到显著变化。这些结果表明，将拉曼光谱与多变量分析相结合，可以实现非破坏性地追踪白血病细胞对靶向治疗的反应，并有助于开发精准肿瘤学中的药物监测工具。
引言
鲁索利替尼（RUX）已获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准，用于治疗特应性皮炎、骨髓纤维化、原发性血小板增多症和真性红细胞增多症。最近，有研究尝试验证其在治疗具有JAK2功能获得性突变的儿童B–ALL中的疗效[1]。RUX是一种选择性JAK1/JAK2抑制剂，可针对这种白血病亚型中常见的异常JAK-STAT信号通路。
光学成像技术的最新进展使拉曼光谱成为生物医学和药物研究中的强大无标记工具。通过检测激光光的不弹性散射，可以实现非侵入性的多通道分子振动分析，从而获得单个细胞的详细生化特征。结合机器学习技术，拉曼光谱能够在单细胞水平上进行高通量、无偏的分析。这种技术已在血细胞[2]、[3]、[4]以及白血病研究[5]、[6]、[7]、[8]、[9]中显示出其价值，包括白血病类型和亚型的鉴定[5]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]，还用于研究化疗[11]和药物耐药性[16]对白血病的影响。
拉曼光谱还被证明是研究药物-细胞相互作用的有效方法，能够定位和量化生物基质中的药物化合物。由于RUX含有硝基官能团，其独特的化学结构使其成为基于拉曼分析的理想候选物，因为CN伸缩振动在约2250 cm?1处有明显的吸收峰。自发拉曼光谱和相干拉曼光谱的优势被用于监测RUX与体外裸鼠耳皮肤的相互作用，从而揭示了各种制剂中的药物经皮检测和定量情况[17]。然而，目前尚未有关于RUX在白血病模型中应用的拉曼光谱研究。
本文对携带JAK2假激酶结构域点突变（MUTZ–5中的R683G和MHH–CALL–4中的I682F）的B–ALL细胞系进行了体外拉曼光谱分析，以研究RUX治疗的分子和代谢效应。由于JAK2–STAT信号通路的持续激活，MHH–CALL–4和MUTZ–5细胞可作为研究靶向JAK–STAT通路的药物细胞效应的理想模型（这种细胞的基因表达特征与携带费城染色体的白血病相似，但染色体中不存在该染色体[1]）。将拉曼成像与监督和非监督的数据挖掘方法相结合，证明了拉曼光谱在体外模型中监测RUX效应的可行性。我们发现了与药物-细胞相互作用和细胞内代谢改变相关的特定光谱特征。总体而言，这些结果展示了拉曼光谱在药物化学乃至更广泛的药物化学领域的广泛应用。
结果与讨论
RUX用于治疗类似费城染色体的白血病仍属于新兴方法，需要监测B–ALL细胞的化学敏感性。拉曼光谱是追踪RUX引发的化学变化的理想工具。为此，我们构建了一个包含两种JAK2-STAT5信号通路持续激活的B–ALL细胞系以及一个携带野生型JAK2基因的B–ALL细胞系的体外模型。
结论
拉曼光谱结合机器学习方法，揭示了JAK2功能获得性突变ALL细胞中JAK–STAT通路抑制所导致的代谢变化。降维方法（如t-SNE和PCA）有助于区分处理过的细胞和未处理过的细胞，而o-PLS-DA分类进一步增强了这一效果，同时识别出对细胞分类重要的变量。
细胞系和培养条件
人类B细胞前体ALL细胞系MUTZ–5、MHH–CALL–4和SEM购自DSMZ。MUTZ–5和MHH–CALL–4分别携带JAK2基因的R683G和I682F突变。这两种突变导致JAK2及其靶标STAT5通过持续磷酸化而被激活[40]。表达野生型JAK2基因的SEM细胞系作为阴性对照。MHH–CALL–4细胞在RPMI 1640培养基（Gibco）中培养。
相关内容
附有化学计量模型详细信息和核光谱数据分析结果的补充图表。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益或个人关系：沃伊切赫·姆林纳尔斯基（Wojciech Mlynarski）和马尔戈扎塔·巴拉恩斯卡（Ma?gorzata Baranska）表示获得了波兰科学基金会的财务支持。马尔戈扎塔·巴拉恩斯卡教授是《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》的主编。若有其他作者，他们也声明自己没有已知的财务利益或可能影响研究的个人关系。
致谢
本研究得到了“无标记和快速光学成像、检测及白血病细胞分选”项目的支持，并在波兰科学基金会的Team-Net计划（POIR.04.04.00-00-16ED/18-00）下进行，该项目得到了欧盟欧洲区域发展基金的共同资助。研究使用的设备也获得了波兰科学与高等教育部（Ministry of Science and Higher Education）的资助（项目编号：35/598515/SPUB/SP/2024）。
