《Talanta》：A hyperbranched polymer-based stationary phase for hydrophilic interaction chromatography
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通过点击化学方法，将超支化聚（硫醚胺）涂层修饰到水解聚（环氧乙烷-二乙烯苯）微球上，成功制备出高亲水性HILIC色谱柱。该柱具有丰富的极性基团（醚键、硫键、胺基等），显著降低梯度洗脱时的泄漏现象（较商业产品低2.1-554.8倍），适用于维生素、氨基酸、有机酸及糖类等极性化合物的高效分离。
作者：余子腾、王倩、罗曦、张菲芳、杨冰城
中国华东科技大学药学院生物反应器工程国家重点实验室，上海光遗传技术细胞代谢前沿科学中心，药物工艺化学工程研究中心，上海200237
摘要：
本文介绍了一种基于聚合物的固定相，该固定相经过超支化涂层修饰，用于亲水相互作用色谱（HILIC）。通过将半胱氨酸接枝到水解后的聚（缩水甘油甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯）微球上，然后通过连续的“硫醇-烯”和“环氧-胺”点击反应一步法引入超支化聚（硫醇醚胺）制备得到该固定相。该固定相具有高亲水性，其在水溶液中的分散性非常好，能够有效分离多种极性分析物，包括维生素、氨基酸、有机酸和糖类。对于模型核苷，其保留行为遵循典型的HILIC机制。值得注意的是，在梯度洗脱模式下，该柱子的渗漏量极低，最高可达50%的水相比例时，其渗漏量仅为商业同类产品的2.1至554.8倍。
引言
自1990年引入以来[1]，亲水相互作用液相色谱（HILIC）已成为分离极性分析物的强大技术。HILIC的分离选择性主要由固定相决定，而流动相相对简单——通常是由高比例的有机溶剂与少量水混合而成，可选地含有低浓度的挥发性盐[2]。为了满足不同分析物的分离需求，已经开发了多种类型的HILIC固定相[3]。
目前，大多数HILIC固定相基于硅胶，并通过化学方法引入极性官能团[4]、[5]、[6]、[7]。这些固定相对高极性分析物具有有效的分离能力，并得到了广泛应用。然而，基于硅胶的固定相存在固有的局限性，如较窄的pH耐受范围（通常为2-8）和有限的水解稳定性[7]。在HILIC模式下，这一问题尤为明显，因为它可能导致在水溶液中的溶解现象（也称为柱子渗漏）。这种渗漏会导致色谱性能下降、噪声增加以及梯度洗脱模式下的基线漂移[8]、[9]，尤其是在使用质谱仪（MS）、蒸发光散射检测器（ELSD）和带电气溶胶检测器（CAD）等质量依赖型检测器时。渗漏甚至被称为极性固定相的“阿喀琉斯之踵”[10]。
为了解决这个问题，提出了几种方法，包括：(a) 使用具有多个接枝点的硅胶[11]或用纳米聚合物颗粒[12]或聚合物涂层[7]进行包覆；(b) 通过表面修饰使用惰性非硅胶微球，如多孔石墨碳（PGC）[13]或聚合物[14]。后者由于具有惰性，是制备低渗漏极性固定相的更优选择。然而，与硅胶相比，聚合物微球具有较大的疏水性，在水中的分散性较差。因此，需要对这些微粒进行必要的表面修饰以制备极性固定相。
最近，聚（缩水甘油甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯）（GMA-DVB）聚合物凝胶因其高化学稳定性、较宽的pH耐受范围和易于表面修饰而受到广泛关注[15]、[16]。我们的团队通过将半胱氨酸[14]、赖氨酸[17]或酰胺基磺丁胺[18]接枝到水解后的GMA-DVB颗粒上，开发了三种类型的两性离子固定相。这些固定相表现出良好的亲水特性和极低的柱子渗漏。与这些接枝的小分子单体不同，超支化聚合物是高度支化的三维大分子。它们的球形和树枝状结构提供了独特的结构和性质，如丰富的官能团和分子内空腔，已在许多领域得到应用[19]、[20]。在这里，我们描述了一种通过一步法（涉及硫醇-烯和环氧-胺点击反应）用亲水聚合物修饰水解后的GMA-DVB微球的方法，制备出含有丰富醚键、硫化键以及胺基和羟基官能团的超支化聚（硫醇-醚胺）聚合物涂层。这些官能团有效地掩盖了疏水性聚合物颗粒。该设计的目的是创建一种具有极低柱子渗漏的高亲水性固定相。
试剂和材料
烯丙基缩水甘油醚（AGE，99%）购自J&K Scientific（北京，中国）。偶氮二异丁腈（AIBN）和盐酸半胱氨酸（CYS）购自Aladdin Corp.（上海，中国）。HPLC级别的乙腈和甲醇来自Titan Technology（上海，中国）。其他分析物为分析级，购自Aladdin Corp。超纯水由Milli-Q系统（Millipore Corp.，美国）提供。
仪器
色谱分离使用LC-20AD（岛津）仪器进行。
G-AT的表征
元素分析结果显示，G-AT中的氮（0.06-0.88%）和硫（0.00-1.83%）含量明显高于裸露的GMA-DVB微球（G0），这直接证明了成功的功能化（见表S2）。G0和G-AT的FTIR光谱见图S1。与G0相比，G-AT在1058.74 cm-1处出现一个新的吸收峰，并且在1114.67 cm-1和1195.67 cm-1处出现了显著增强的峰。这些峰归因于...（原文此处内容不完整）
结论
本文描述了一种通过表面修饰引入超支化涂层制备的基于聚合物的极性固定相。所得固定相具有“刷状”结构，含有丰富的极性官能团（醚、硫化物、胺、羟基和羧酸基），有效掩盖了疏水性基底，表现出优异的亲水性和对常见极性分析物的有效分离性能。该柱子的渗漏量极低，有利于快速洗脱。
作者贡献声明
余子腾：撰写初稿，方法学设计。
王倩：验证，资源准备。
罗曦：监督，数据管理。
张菲芳：项目管理。
杨冰城：撰写、审稿与编辑，监督，概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：22374046）的资助。同时感谢中央高校基本科研业务费的支持。
