《Talanta》：Structure-initiated CHA variant coordinating SDA for cascade amplification in CRISPR/Cas12a-based miRNA analysis
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本研究开发VCHA-SDA/Cas12a新型生物传感平台，通过催化发夹组装（VCHA）与链置换扩增（SDA）协同作用，结合CRISPR/Cas12a实现miRNA-155高灵敏度检测，检测限达0.166 pmol/L，成功应用于临床血浆及肺癌细胞系验证。
费宇|段月|王芳婷|傅 Bowen|秦戈|魏山|臧文桥|张琼文|崔玲玲|王涛
郑州大学公共卫生学院，中国河南省郑州市，450001
摘要
微小RNA（miRNA）是肿瘤诊断和监测的公认生物标志物。本文报道了一种新型生物传感平台，该平台通过设计一种结构驱动的催化发夹组装（VCHA）变体，并将其与链置换扩增（SDA）相结合，以实现基于CRISPR/Cas12a的级联扩增检测。该系统使用三种发夹探针，当它们识别到目标miRNA时，会自组装成一个关键的5′端悬挂的三联体（5′-DTC）结构。这一结构作为唯一的触发机制，通过聚合酶和切割酶的协同作用，同时启动VCHA循环和SDA过程。因此，VCHA和SDA在统一的电路中协同工作，生成大量的单链激活DNA（acDNA）产物。这些acDNA分子随后激活CRISPR/Cas12a的切割活性，产生显著放大的荧光信号。VCHA-SDA/Cas12a平台在miRNA-155检测中表现出优异的性能，检测范围广泛（1 pmol/L至10 nmol/L），检测限低至0.166 pmol/L。此外，该平台还成功量化了临床血浆样本和多种细胞系中的miRNA水平，证实了其作为分子诊断和临床应用的强大潜力。
引言
微小RNA（miRNA）是一类小型、单链、非编码的RNA分子（18-24个核苷酸），可调节转录后基因表达[1,2]。越来越多的证据表明，体液中miRNA表达水平的异常与癌症的发生和发展相关[3,4]，这使得miRNA定量对于疾病诊断和治疗评估至关重要[5,6]。
虽然传统的测序和RT-qPCR方法仍是临床标准[7,8]，但它们对昂贵仪器和复杂数据分析的依赖限制了其广泛应用[9,10]。等温核酸扩增技术（INAATs）通过简化的工作流程和降低成本提供了有前景的替代方案[11,12]。与PCR不同，INAATs（包括酶辅助和无酶版本）能够在恒定温度条件下高效扩增核酸，无需热循环[13,14]。最近的进展产生了多种等温扩增策略，用于核酸检测[15]，包括滚环扩增（RCA）[16,17]、杂交链反应（HCR）[18,19]、催化发夹组装（CHA）[20,21]和链置换扩增（SDA）[22,23]。其中，CHA因其设计灵活性和高扩增效率而脱颖而出[24]。然而，CHA的应用受到三个关键限制：（i）非特异性触发导致的电路泄漏；（ii）由于严格的热力学要求而带来的设计复杂性；（iii）完全依赖熵驱动过程导致的反应动力学不佳[25]。为了解决这些问题，研究人员将CHA与其他扩增方法（如HCR、SDA、RCA）结合，开发出了改进的生物传感平台[26,27]。值得注意的是，SDA因其简单的设计和协同扩增效果而成为与CHA整合的首选伙伴[28, [29], [30]]。我们的研究表明，将SDA与CHA结合可以通过协同的熵-聚合酶驱动扩增来减少电路泄漏并显著提高检测效率。
CRISPR/Cas系统最近彻底改变了生物传感和诊断领域[31, [32], [33]]，其中CRISPR/Cas12a因其高特异性[34]、自我扩增能力和快速操作而特别有价值[35]。尽管许多研究已将CRISPR/Cas12a与等温扩增技术结合以提高灵敏度[36]，但CHA-CRISPR的整合仍较少探索[37,38]。这一限制源于CHA产物主要通过双链DNA（dsDNA）中间体激活Cas12a，而这些中间体需要原间隔序列（PAM）[39,40]，这限制了设计灵活性[41]。为克服这一障碍，我们提出了一种新的整合策略，利用SDA作为CHA和Cas12a之间的分子桥梁，实现高效的信号转换和扩增。
在这项工作中，我们设计了三种发夹探针，当它们识别到miRNA155时，可以自组装成一个5′端悬挂的三联体（5′-DTC）。Klenow片段（KFexo-，KF）聚合酶在5′-DTC结构内沿三条路径进行定向延伸：第一条路径置换目标miRNA以启动VCHA循环；另外两条路径生成dsDNA结构，这些结构被Nt.BbvCI切割产生双引物。这些引物随后结合双功能模板，触发多轮SDA扩增，生成大量的单链DNA（ssDNA）。ssDNA产物激活CRISPR/Cas12a介导的切割活性，从而产生放大的荧光信号。与传统CHA和单扩增系统相比，我们的VCHA-SDA/Cas12a平台具有三个显著优势：（1）VCHA技术解决了简单CHA固有的泄漏问题，同时提高了灵敏度和特异性；（2）SDA将VCHA产物转化为ssDNA，使得CRISPR/Cas12a的激活不受PAM序列限制；（3）双引物识别模板设计提高了反应效率，缩短了处理时间。该VCHA-SDA/Cas12a系统在人血清样本和多种肺癌细胞系中成功检测到了miRNA155，其结果与RT-qPCR结果高度一致。这一验证证实了其作为准确、可靠且高灵敏度生物标志物检测平台的实用性。
探针设计与制备
核酸探针包括三种发夹探针（H1、H2、H3）、一个双功能模板链（M）以及一个荧光淬灭剂（FQ）探针。首先，H1、H2和H3被设计为在识别miRNA155后自组装成一个复合体，通过KF聚合酶启动VCHA循环。Nt.BbvCI切割产生的dsDNA释放出两个引物，这些引物与模板M结合，触发SDA生成激活DNA（acDNA）。
VCHA-SDA/Cas12a平台原理
为了开发一种高灵敏度和高效的检测策略，我们设计了一种多重等温扩增技术，将CHA的变体与SDA结合，并将其与CRISPR/Cas12a切割系统耦合以实现信号读取。如图1所示，使用了三种经过合理设计的发夹探针（H1、H2和H3），并优化了它们的热力学参数以最小化非特异性杂交。当目标
结论
为了解决传统催化发夹组装的固有局限性，我们开发了一种新型的多重等温扩增策略——VCHA-SDA/Cas12a系统，用于超灵敏度检测miRNA155。该策略基于三种发夹探针的合理设计，当它们识别到目标时，会自组装成一个5′-DTC结构。该结构随后由KF聚合酶处理，沿着三条独立路径进行延伸：其中一条路径置换目标miRNA
CRediT作者贡献声明
费宇：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、监督、项目管理、方法学、研究、资金获取、数据管理、概念化。
段月：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件、数据管理。
王芳婷：软件、数据分析。
秦戈：软件、数据分析。
魏山：软件、数据分析。
臧文桥：
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢河南省自然科学基金项目（项目编号：252300421355）、河南省科技研究项目（项目编号：242102310034和252102311168）以及郑州大学的本科生创新与创业培训计划（项目编号：2025cxcy743）提供的财政支持。
