利用软质DNA纳米球作为硬质纳米颗粒的优越替代品，以增强基于DNA酶的铅离子比色传感性能

《Talanta》：Harnessing soft DNA nanospheres as a superior alternative to hard nanoparticles for boosting DNAzyme-based colorimetric sensing of lead ions

本研究开发了一种基于DNA纳米反应器的比色传感器，用于高灵敏检测环境中的铅离子。通过自组装单链DNA形成纳米球，构建空间受限环境，显著增强DNA酶活性，实现检测限0.96 nM，优于传统纳米材料方法，并验证了在复杂样品中的可靠性和选择性。

　　

余恒新|林国海|蒋静|蔡淼淼|乔月|徐浩

中国福建省农村废弃物回收技术工程研究中心，福州大学环境与安全工程学院，福州，350108

摘要

铅离子（Pb²⁺）作为一种持久性和生物累积性的环境毒素，对公众健康构成了重大威胁，因此需要超灵敏且可在现场应用的检测方法。传统传感器在灵敏度和稳定性之间往往难以平衡，尤其是在使用金纳米颗粒等硬纳米材料增强剂时。然而，这些无机纳米探针的实际效用常常受到其表面钝化（生物污染）和在富含盐分或蛋白质的环境中聚集的影响。本文介绍了一种基于软物质的DNA纳米反应器的新型概念，用于构建高性能比色生物传感器。该纳米反应器由单条回文DNA链自组装成DNA纳米球（DS），形成一个空间受限的微环境。通过将一种针对Pb²⁺的DNA酶系统锚定在该平台上，我们开发出了DS-S-Dz探针。这种纳米反应器结构通过显著的空间限制效应极大地提高了DNA酶的催化效率，加速了Pb²⁺引发的底物链断裂以及随后富含G的序列的释放。释放出的序列随后折叠成G四链体/血红素DNA酶，从而催化出强烈的比色反应。这一策略有效抑制了背景噪声，同时放大了目标信号，实现了0.96 nM的检测限，比未放大的系统（48 nM）提高了50倍，并远低于美国环保署（EPA）的安全限值（72 nM）。该传感器在一系列干扰金属离子中表现出优异的选择性，并在自来水、牛奶等复杂实际样品中证明了其稳定性和准确性。这项工作标志着从简单的纳米颗粒增强向可编程DNA纳米反应器理性设计的转变，为敏感可靠的环境监测提供了一个强大而优雅的平台。

引言

重金属污染的日益严重威胁是21世纪最紧迫的环境挑战之一，其中铅离子（Pb²⁺是一种特别有害且广泛存在的污染物[1]。铅离子来源于多种人为来源，包括工业废水、采矿活动、铅酸电池处理、老化的水基础设施以及含铅涂料，它们渗透到我们的空气、水和土壤中[2]。与有机污染物不同，这种元素毒素不可生物降解，能够在生态系统中长期存在[3,4]。其隐蔽性还因其易于生物累积而加剧，会在食物链中逐渐积累，最终对人类健康构成严重而直接的威胁。铅暴露的生理后果是严重的、慢性的和系统性的。即使在纳摩尔浓度下，长期暴露也会造成不可逆的损害，儿童尤其脆弱。在发育中的大脑中，Pb²⁺作为一种强效的神经毒素，会干扰突触发育，导致认知缺陷、智商下降、学习障碍和行为障碍。在成人中，它会悄悄攻击多个器官系统，引发肾功能障碍、心血管疾病（如高血压）和生殖问题。铅中毒的累积性和通常无症状的特性凸显了进行严密环境监测的迫切需求[5,6]。为应对这一全球健康危机，世界卫生组织（WHO）和美国环境保护署（EPA）等监管机构为饮用水中的Pb²⁺制定了严格的最大污染物限值，通常在低纳摩尔范围内（例如，EPA规定的72 nM），这要求分析技术具有极高的灵敏度和可靠性[7]。

目前痕量金属分析的黄金标准依赖于原子吸收光谱（AAS）[8]、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）[9]和阳极剥离伏安法（ASV）[10]等复杂仪器技术[8]。尽管这些方法具有无与伦比的准确性和低检测限，但它们在实际的广泛实时监测中的应用受到重大后勤和经济障碍的严重限制。这些方法仅限于中央实验室，需要大量资本投资于仪器设备，需要经过高度培训的人员操作，并且通常涉及繁琐且耗时的样品预处理步骤。这种固有的复杂性导致了即时现场数据需求与现有分析能力之间的关键脱节。因此，现代分析化学的一个关键目标是开发便携、成本效益高、用户友好且能够在现场快速提供准确结果的替代传感平台[11]。在这方面，比色策略因其简单性和无需仪器的读数方式而成为一种有前景的解决方案。最近的研究，如Park等人描述的基于纳米颗粒的检测方法[12]和Tan等人开发的便携式传感平台[13]，展示了光学传感在环境监测中的巨大潜力。

在这种背景下，功能性核酸领域推动了生物传感器设计的范式转变[14,15]。DNA酶是通过体外选择工程化设计的催化DNA链，已成为卓越的分子识别元件。它们结合了多种理想属性，非常适合传感应用：与抗体相当的目标特异性、出色的化学稳定性、低成本和高保真度的合成，以及在信号转导设计方面的卓越多功能性[16,17]。对于Pb²⁺的检测，一种特别优雅的策略是协同使用两种不同的DNA酶系统。第一种是依赖Pb²⁺的DNA酶，它能特异性识别Pb²⁺作为催化互补底物链在单个核苷酸连接处断裂的必要辅因子[18,19]。第二种是G四链体（G4）DNA酶，这种由富含G的DNA序列形成的结构与血红素结合后表现出强大的过氧化物酶活性[20]。通过将富含G的序列战略性地嵌入底物链中，第一种DNA酶对其的切割可以触发第二种DNA酶的形成，从而将目标结合事件转化为易于测量的比色或荧光信号[21,22]。然而，一个根本性挑战仍然存在：在均匀溶液中操作时，该系统的效率受到缓慢扩散限制的动力学和非特异性背景信号的潜在影响，这些因素共同限制了可实现的灵敏度，阻碍了根据健康法规要求的超痕量Pb²⁺的可靠检测[23]。

为了克服这些动力学和热力学障碍，研究人员越来越多地转向基于纳米材料的放大策略[24,25]。目前的主流方法使用“硬”无机纳米颗粒（尤其是金纳米颗粒（AuNPs）作为支架来浓缩DNA酶探针，从而提高它们的局部有效摩尔浓度。

虽然这种策略显著提高了灵敏度，但它并非万能解决方案。单分散且稳定的AuNPs的合成可能很复杂，并且批次间存在变异性。更关键的是，这些纳米颗粒的无机表面容易吸附实际样品中的生物分子（例如蛋白质、腐殖酸），这种现象称为生物污染。这可能会使纳米颗粒表面钝化，从空间上阻碍DNA酶的催化活性，从而影响传感器在河水或牛奶等复杂基质中的可靠性[26,27]。

在这里，我们超越了传统的硬纳米材料，提出了一种基于软物质的DNA纳米反应器的理性设计，以革新Pb²⁺的检测方法。我们设计了一种由单条巧妙设计的回文DNA链自组装而成的DNA纳米球（DS）。这种全DNA纳米结构不仅作为一个被动支架，还作为一个主动的空间受限催化中心。通过将响应Pb²⁺的DNA酶（Dz）及其底物（S）锚定在DS表面，我们创造了DS-S-Dz探针。这种独特的结构利用空间限制效应显著提高了反应物的有效摩尔浓度，限制了它们的相互作用，从而加速了Pb²⁺引发的切割反应，并最小化了非特异性背景信号。切割后，会释放出一个富含G的片段，该片段迅速形成G四链体/血红素复合物，催化出强烈的比色信号。这种基于纳米反应器的方法提供了稳定性和灵敏度的协同增强，为在各种环境和生物样品中检测Pb²⁺提供了一种简单、直观且高度可靠的方法，展示了可编程DNA纳米技术在解决紧迫分析挑战方面的巨大潜力。

材料与试剂

所有DNA寡核苷酸（表S1）均由Sangon Biotech有限公司（中国上海）使用高效液相色谱（HPLC）合成和纯化。DNA序列溶解在1×TE缓冲液中，浓度为10 μM。低分子量标记物和6×DNA加载缓冲液由New England Biolabs有限公司（中国北京）提供。以下试剂由Dingguo Changsheng Biotechnology有限公司（中国北京）提供：30%

基于DNA纳米反应器的比色传感器的理性设计

本文提出的策略侧重于创建一种可编程的DNA纳米反应器，精心设计以克服传统基于DNA酶的传感器固有的动力学和灵敏度限制。传感器的概念框架和操作原理如图1所示。该设计由两个核心模块组成，集成到一个最终的高性能探针中。

第一个模块是核心分子开关和信号生成系统（图1A）。

结论

总之，我们成功概念化并展示了一种基于可编程软物质DNA纳米反应器的新型传感范式，用于超灵敏和可靠地检测Pb²⁺。通过超越简单的纳米颗粒载体，设计出一个自组装的全DNA催化中心，我们有效地利用了空间限制效应，显著提高了针对Pb²⁺的DNA酶的性能。这一创新设计使得传感器的检测限达到了

CRediT作者贡献声明

余恒新：撰写——原始草稿、验证、研究、数据管理。林国海：软件开发、研究、正式分析、数据管理。蒋静：软件开发、研究、正式分析。蔡淼淼：验证、正式分析。乔月：软件开发、正式分析。徐浩：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、正式分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了福建省自然科学基金（项目编号：2021J011039）、中华人民共和国科学技术部的高端外国专家引进计划（项目编号：G2021020006L）以及国家自然科学基金（NSFC）（项目编号：22104111）的支持。