肝细胞癌（HCC）在全球范围内发病率很高，是导致癌症死亡的第三大原因[1,2]。HCC常发生在乙型肝炎病毒（HBV）相关肝硬化患者中，其生存率通常较低[3,4]。因此，HCC的早期诊断尤为重要。目前，主要的非侵入性早期诊断生物标志物包括甲胎蛋白（AFP）、脱γ-羧基凝血酶原、磷脂酰肌醇-3和转化生长因子β-1（TGF-β1）[5], [6], [7], [8], [9]。在我们之前的研究中，我们发现HepG-2细胞受损后，细胞内的人类羧酯酶1（CEs1）水平显著降低[10,11]。同时，HCC患者的血浆CEs1水平与健康捐赠者和肝炎或肝硬化患者相比有所升高[12,13]。然而，仍需进一步研究以阐明人类CEs1在HCC中的分子机制和细胞信号传导事件[14]。
CEs1是一种丝氨酸酯酶，在Asn79位点具有独特的N-连接高甘露糖糖基化位点，可作为HCC早期诊断及其与其他肝脏疾病区分的候选血清学生物标志物[2]。Keun等人报告称，CEs1通过PKD1/PKCμ信号通路在癌细胞中表现出抗增殖作用，其Asn79位的单一N-连接糖基化位点影响CEs1的活性，从而发挥潜在的调节作用[14]。因此，开发一种快速、灵敏且准确的糖基化CEs1检测方法对于全面理解这一机制至关重要，这将有助于阐明疾病发展的生物学功能和分子机制，进而有助于预防HCC的发生。
蛋白质特异性糖基化是生物体内普遍存在、复杂且关键的蛋白质翻译后修饰[15,16]。蛋白质与糖链之间的关系对于准确检测蛋白质特异性糖基化至关重要。通常使用两种类型的鉴定工具来研究蛋白质特异性糖基化：目标蛋白质特异性抗体和目标糖链特异性凝集素。这些方法无法区分蛋白质及其糖链部分，这使得同时识别目标蛋白质及其特定糖基化模式变得更加困难[17], [18], [19]。因此，在生物分析科学领域，蛋白质特异性糖基化的检测，尤其是原位定量分析，仍然是一个重大挑战[20]。
在检测蛋白质特异性糖基化水平时，常用的方法包括荧光共振能量转移（FRET）、流式细胞术（FCM）、毛细管电泳-质谱（CE-MS）、毛细管液相色谱-质谱（capLC-MS）和DNA组装-碱基错配加速链置换反应（BINDA-BM-TMSD）。近年来，FRET技术与代谢寡糖工程（MOE）相结合，被广泛用于糖链的可视化及不同糖蛋白类别的鉴定。MOE技术通过向糖链引入叠氮基团，然后通过环辛炔化合物与叠氮标记的糖链特异性交联来实现目标糖基化的定位。结合抗体介导的蛋白质特异性识别，这种方法有效解决了目标蛋白质及其特定糖基化模式的双重识别难题[21]。然而，由于强烈的背景荧光，FRET技术的应用受到限制，这降低了成像的信噪比和灵敏度[22,23]。尽管FCM技术能够在单细胞水平上检测细胞表面糖蛋白，但它无法提供全面的糖链结构信息[24], [25], [26], [27]。CE-MS和capLC-MS可以检测糖肽水平的糖蛋白，但CE-MS无法区分具有相同唾液酸含量但糖基化分支模式不同的糖链变体。虽然capLC-MS可以在特定糖链类型中区分唾液酸衍生的糖链变体，但其分辨率仍低于CE-MS[28]。BINDA-BM-TMSD方法能够高度灵敏且快速地检测糖蛋白肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP），但由于需要昂贵的设备、专业操作人员以及额外的稀释或浓缩步骤，增加了测量误差的风险[29]。Giuseppe等人使用液相色谱与质谱结合的方法系统分析了唾液中的酸化糖链、糖肽和糖蛋白的结构和表达特征[30]。然而，该方法需要繁琐的样品预处理、依赖复杂的仪器，并且检测周期较长，因此不适用于快速即时检测和生物医学应用的需求。
相比之下，SERS传感器技术由于其灵敏度高、速度快、无创性、指纹识别能力和多重检测能力等优点，在检测蛋白质特异性糖基化水平方面具有巨大潜力[31,32]。Chen等人开发了两种纳米探针，用于细胞表面蛋白质特异性糖基化的拉曼成像。该方法不仅成功应用于MCF-7细胞表面唾液酸的成像，还用于监测药物治疗过程中蛋白质特异性糖基化的变化[33]。Bi及其同事使用银核-金卫星纳米结构，包裹
-氨基噻唑酚（PATP），并与噻吩基硼酸（PMBA）和PMBA自组装单层结合，在光滑的金涂层基底上实现了糖蛋白的SERS检测[34]。Chen等人设计了一种基于银纳米线-水凝胶复合双功能基底的SERS检测技术，用于检测汗液中的糖蛋白和肺癌生物标志物[35]。该方法在肺癌的非侵入性早期筛查中显示出99%的诊断准确性，为开发更高效和精确的糖蛋白检测平台提供了重要的理论基础和技术支持。
本研究开发了一种双金纳米探针系统，该系统具有区域特异性的SERS效应，用于检测用叠氮试剂Ac4ManNAz代谢标记后的糖基化CEs1。糖链探针由10纳米的金纳米颗粒组成（几乎无SERS效应），这些颗粒经过拉曼报告分子5,5′-二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和二苯基环辛炔（DIBO）修饰。DIBO可以通过无铜点击化学和MOE与糖基化CEs1糖链末端的叠氮基团连接，从而实现探针的糖链识别能力。经过抗CEs1的表面修饰后，40纳米的金纳米颗粒作为蛋白质探针，用于特异性识别糖基化CEs1，并作为SERS基底。随后，糖链探针和蛋白质探针依次识别糖基化CE1上的糖链，使两个探针紧密靠近。这种接近性促进了探针之间强烈的SERS效应和DTNB拉曼信号的生成，从而实现了对Ac4ManNAz-代谢标记的糖基化CEs1的特异性检测。最终，该策略被应用于监测用肝毒性药物刺激的HepG-2细胞培养基中糖基化CE1的动态变化。通过建立“药物刺激→糖基化CE1释放→肝脏损伤严重程度”的定量关联，本研究初步揭示了肝脏损伤和HCC发展过程中糖基化CE1水平的变化。
