高选择性荧光探针用于DNA的关闭检测及其在细胞中的生物应用

《Tetrahedron》：Highly selective fluorescent probe for the turn off detection of DNA and its bioapplications in cells

基于单线态形成的DNA"关断"检测荧光探针NP-PY的合成与应用，该探针通过π-π堆积和静电作用与DNA结合引发荧光淬灭，检测限达59 nM，在pH 5.0-12.0范围内稳定，可通过添加Ca2?实现荧光恢复。细胞实验显示其具有低毒性、高光稳定性及线粒体靶向性，实现活细胞动态DNA成像。

　　

周传燕|蔡松涛|刘畅|周飞阳|王志峰|曾宪顺

天津工业大学材料科学与工程学院光电材料与器件国家重点实验室，教育部显示材料与光电器件重点实验室，中国天津300384

摘要

开发用于检测DNA的荧光探针对分子生物学和生物医学研究具有重要意义。本文介绍了一种阳离子荧光探针NP-PY，该探针基于激子形成机制实现DNA的“关闭”式检测。NP-PY含有芘和萘酰亚胺-咪唑结构，通过插入作用和静电相互作用与DNA结合，表现出显著的荧光淬灭效应，具有优异的选择性、高灵敏度（59 nM）和快速响应能力，并且耐受广泛的pH范围（pH 5.0-12.0）。在细胞应用中，NP-PY表现出低细胞毒性、高光稳定性以及线粒体靶向能力，并能通过可逆的“关闭/开启”荧光开关实现动态DNA成像。探针与DNA初次结合时会淬灭核荧光，随后加入Ca²⁺可使其解离，从而恢复细胞质中的荧光。NP-PY为活细胞内精确DNA定量和实时追踪提供了一个多功能平台，在细胞成像和生物分析研究中具有巨大潜力。

引言

脱氧核糖核酸（DNA）作为遗传信息的载体，在几乎所有生物体的构建和运作中起着关键作用，它通过存储遗传信息、指导蛋白质合成、调控基因表达等过程，与许多疾病（如亨廷顿病、癌症、糖尿病、心脏病）密切相关。[1] [2] [3] [4] [5] [6] 值得特别注意的是，DNA极易与化学小分子结合，导致生理功能发生变化，这种结合基于嵌入、沟槽结合、静电作用和π-π堆叠等相互作用。[7] [8] [9] [10] [11] 因此，研究DNA与化学小分子的结合有助于更深入地了解DNA的生理和病理功能，并为合理设计针对DNA的有效药物提供途径，同时也有助于开发敏感的DNA结构检测探针。[12] [13] [14] [15] 迄今为止，基于对化学小分子与DNA相互作用的深入研究，已经开发出多种DNA检测方法，如银染色、放射性标记和有机染料染色。[16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] 其中，由于荧光探针具有可设计性、快速信号响应、高选择性和生物相容性，被推荐为细胞内可视化DNA的有力工具（见表S1）。[23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] 例如，曾宪顺等人首次报道了间苯二酚与DNA的结合特性，并通过静电相互作用证明了其与DNA磷酸骨架结合导致的荧光淬灭现象，揭示了小分子与DNA结合的机制。[31] Bandyopadhyay开发了一种双阳离子四苯衍生物探针，通过静电相互作用和部分插入作用实现对DNA的敏感和定量检测。[32] 然而，在复杂的生物环境中选择性和细胞环境中荧光信号较弱等因素限制了DNA探针在生物荧光成像中的应用。因此，开发同时具有高选择性和良好生物成像能力的DNA探针仍然是一个挑战。 本文设计并合成了一种新型阳离子荧光探针NP-PY，该探针将芘和萘酰亚胺-咪唑结构整合到一个空间扭曲的构架中以防止聚集。这种设计使探针能够通过双重插入作用和静电相互作用与DNA结合，触发激子形成，从而立即产生“关闭”荧光响应，在饱和状态下荧光淬灭程度超过85%。通过加入竞争性金属离子（如Ca2+、K+、Na+、Cu2+和Zn2+）可以恢复荧光，证实了这一检测机制。NP-PY表现出卓越的分析性能，如高灵敏度（检测限低至59 nM）、对多种生物干扰物的优异抗干扰能力以及在广泛pH范围（5.0-12.0）内的稳定性能。更重要的是，NP-PY探针与HeLa细胞共培养后表现出低细胞毒性和高光稳定性，并能通过可逆的“关闭/开启”荧光开关实现动态DNA成像。

结果与讨论

为了开发用于快速和特异性检测DNA的荧光探针，选择了芘，因为它具有较高的摩尔消光系数和广泛的芳香疏水表面，这有助于其插入DNA沟槽或作为分子支架的组成部分。[33] [34] [35] 为了解决芘因强烈的π-π堆叠相互作用而聚集的问题，将萘酰亚胺-咪唑结构与芘结合，制备了NP-PY探针。

结论

总结来说，我们设计、合成并表征了一种阳离子荧光探针NP-PY，该探针通过插入作用和静电相互作用的双重机制与DNA结合后，基于激子形成实现高度选择性的“关闭”式DNA检测。NP-PY表现出优异的分析性能，包括极高的灵敏度（检测限低至59 nM）和对多种生物分子和离子的优异抗干扰能力。

合成与表征

详细合成路线如图1所示。化合物1、化合物3和化合物4的合成方法参照了先前报道的文献。[40] [41] [42] 化合物3的合成：将1克（2.82 mmol）的化合物1和4.91克（21.76 mmol）的SnCl2•2H2O溶解在50毫升乙醇中，加入1毫升浓盐酸（12 M），在氩气保护下回流过夜。反应结束后在减压条件下蒸馏，将浓缩液倒入50毫升水中。

CRediT作者贡献声明

王志峰：可视化、监督。 曾宪顺：监督、资源获取、概念构思。 刘畅：监督、资源获取、概念构思。 周飞阳：实验研究、数据分析。 蔡松涛：撰写-审稿与编辑、方法学设计、数据分析、概念构思。 周传燕：撰写-初稿撰写、验证、方法学设计、实验研究、数据分析

利益声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

竞争利益声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金（NNSFC，项目编号21907075）和天津市自然科学基金（项目编号23JCZDJC00320和18JCQNJC75900）的支持。