《Veterinary and Animal Science》：Targeting selenometabolites in the saliva of dairy cows: size-exclusion chromatography – inductively coupled plasma mass spectrometry-based characterization
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为探究泌乳牛口内微生物的硒供应来源，研究人员聚焦其唾液中低分子量（LMW）硒代谢物的特征。本研究通过SEC-ICP-MS等技术，首次在奶牛唾液中检出1.78-15.3 μg Se kg?1范围的LMW硒代谢物，发现补充硒蛋氨酸羟基类似物（HMSeBA）并未显著提升血硒浓度，且唾液中LMW硒浓度与血硒浓度无相关性。这提示唾液硒代谢可能受局部调控，为后续研究口腔硒依赖型菌群奠定了方法学基础。
当我们谈论奶牛的健康与产奶品质时，微量营养元素硒（Selenium， Se）扮演着不可或缺的角色。充足的硒摄入对于维持动物的抗氧化功能、免疫应答和繁殖性能至关重要。在养殖实践中，通常通过检测奶牛血液中的总硒浓度或硒蛋白P的水平来评估其硒营养状况。然而，一个长期被忽视的“隐秘角落”正逐渐浮出水面：奶牛庞大的微生物组，特别是位于消化道“前哨站”的口腔微生物群。它们的生存、定植与功能发挥是否也需要硒？如果需要，它们的硒又从何而来？
科学家们推测，唾液——这种易于获取且富含多种生物分子的体液，很可能是口腔微生物获取硒的直接且唯一的便利来源。然而，在此之前，关于奶牛唾液中硒的形态，尤其是可能被微生物直接利用的低分子量（Low Molecular Weight， LMW）有机硒代谢物的组成与浓度，科学界几乎一无所知。这个知识空白不仅限制了我们全面理解硒在奶牛体内的代谢网络，也阻碍了探索硒营养如何通过影响微生物组进而影响宿主健康的研究路径。为了填补这一空白，来自匈牙利兽医大学的研究团队展开了一项开创性的探索。
研究者们首先提出了一个核心假设：奶牛唾液负责为口腔微生物提供易于获取的（即非蛋白结合的）硒，并且其组成及硒的种态可能受到饲料中硒补充形式的影响。为了验证这一假设，他们设计并实施了一项包含概念验证研究和主体喂养实验的综合性研究。研究团队关注的对象是荷斯坦奶牛。在概念验证阶段，他们从饲喂含亚硒酸钠日粮的五头奶牛采集了一次性唾液样本。在主体研究中，他们对12头奶牛的饲料进行了为期五周的干预：在原有亚硒酸钠的基础上，额外添加了欧盟允许最高剂量的有机硒形式——硒蛋氨酸羟基类似物（R,S-2-hydroxy-4-methylselenobutanoic acid， HMSeBA）。研究的主要目标是建立硒补充与奶牛唾液中LMW硒代谢物种态特征之间的联系。
为了达成目标，研究人员运用了几个关键的技术方法体系。第一，样本采集与预处理：使用合成拭子（Salivette? Cortisol）非侵入性采集奶牛唾液，并通过离心、冻干、复溶、过滤以及使用30 kDa截留分子量的离心超滤膜去除主要唾液蛋白（如粘蛋白和α-淀粉酶），从而富集目标LMW组分。同时，也从同一批动物采集了全血和血清样本。第二，总硒含量测定：采用开罐酸消化法处理唾液、全血和血清样本，随后使用电感耦合等离子体-扇形场质谱（ICP-SF-MS）精确测定总硒含量，以确保分析质量。第三，硒种态分析：该研究的核心技术是体积排阻色谱与电感耦合等离子体质谱联用。在概念验证阶段使用了分析级的UPLC SEC柱，而在主体研究阶段则换用了半制备级的SEC柱，旨在分离并检测唾液中的LMW硒代谢物，并通过与标准品对比进行半定量。研究者还尝试了强阴离子交换色谱与ICP-MS联用以检测可能存在的无机硒形态（硒酸盐和亚硒酸盐），并计划未来使用电喷雾电离-高分辨质谱进行代谢物鉴定，尽管在当前样本浓度下未能成功。
研究结果
3.1. 概念验证实验：唾液样本的总硒含量和基于体积排阻色谱的表征
研究人员首先测定了五头奶牛唾液中的总硒含量，范围在16.0-43.6 μg Se kg?1之间。这是首次针对泌乳牛唾液硒含量的报告，尚无生理学参考范围可供比较。随后，他们使用SEC-ICP-MS分析了这些样本。色谱图显示，硒在唾液中并非以单一形态存在，而是可能由4-5种不同的硒代谢物组成，其估算总浓度在4.7-15.3 μg Se kg?1之间（平均8.9 μg Se kg?1）。然而，由于样本在酸性复溶液中出现蛋白聚集，并可能堵塞色谱系统，导致色谱柱回收率最高仅达到40%。这一发现提示，在后续的主体研究中需要增加额外的样本前处理步骤（如超滤）来去除大分子蛋白干扰。
82Se同位素），（b）6.0-7.6分钟洗脱窗口的放大图，显示多个低分子量硒代谢物峰。">
3.2. 主体实验：血液样本的硒含量分析
主体研究聚焦于补充HMSeBA对血液硒水平的影响。数据显示，在额外补充HMSeBA五周前后，奶牛血清硒平均浓度分别为97.4 μg kg?1和110 μg kg?1，全血硒平均浓度分别为222 μg kg?1和229 μg kg?1。统计检验表明，这些变化均不显著。这意味着，在群体饲养条件下，将日硒摄入量从5.9 mg（以亚硒酸钠形式）增加约70%至10.1 mg（额外添加4.2 mg HMSeBA-Se），并未导致血液硒浓度的显著积累。这一结果与一些先前报道HMSeBA能提升血硒水平的研究不尽相同，作者认为群体喂养方式可能是一个重要的限制因素。
3.3. 主体实验：唾液样本的硒含量分析
在改进了样本前处理（去除了>30 kDa的蛋白）并使用半制备SEC柱后，研究人员再次分析了唾液中LMW硒代谢物。结果显示，经浓缩的唾液中LMW硒代谢物的估算浓度范围在12.0-26.1 μg Se kg?1，换算回原始唾液浓度，则范围在1.78-3.88 μg Se kg?1之间（平均2.77 μg Se kg?1）。这一浓度范围显著低于概念验证实验的结果。进一步的SAX-ICP-MS分析也未在唾液中检测到无机硒酸盐或亚硒酸盐。此外，统计分析发现，全血硒、血清硒与唾液中洗脱出的LMW硒浓度之间均不存在显著相关性。
研究结论与讨论
本研究最重要的结论是，成功应用SEC-ICP-MS技术证明了奶牛唾液中存在LMW硒代谢物，但其浓度呈现高度波动（在两项研究中合计范围为1.78-15.3 μg Se kg?1）。研究发现，补充高生物利用度的有机硒HMSeBA并未显著提升血液中的硒浓度，并且唾液中LMW硒的浓度与血液硒水平无关。这强烈暗示，唾液中的硒代谢可能受到局部（如唾液腺）的独立调控，而非简单地反映血液循环中的硒状态。
从生理学角度看，唾液中硒的来源可能分为两类：一是唾液腺自身产生的含硒蛋白（如含有非特异性结合硒蛋氨酸的粘蛋白），二是LMW有机硒代谢物。目前尚不清楚硒在这两类分子间的分布是否受到生理调控。研究发现血液与唾液硒含量无相关性，这间接支持了硒无法通过血液中的主要硒结合蛋白（如白蛋白、脂蛋白）大量进入唾液的观点。因此，唾液硒，尤其是LMW部分，目前还不能作为奶牛硒代谢的可靠诊断或生理相关生物标志物。
在微生物学意义上，如果奶牛口腔中存在硒依赖型微生物群，那么它们获取硒的潜在来源就是上述唾液蛋白或LMW硒代谢物。本研究所测得的LMW硒代谢物浓度（约合22 nM-0.2 μM）为这些微生物提供了可能的硒供应窗口。然而，目前科学界对奶牛任何微生物组（包括口腔）中具体哪些细菌菌株或属具有硒依赖性尚不清楚。验证这一点需要在微生物基因组中寻找硒蛋白编码基因，这依赖于识别特殊RNA结构（SECIS元件），而目前在奶牛微生物组的宏基因组数据中进行此类搜索仍面临巨大挑战。
在方法论上，本研究为分析唾液这一复杂基质中的痕量硒代谢物奠定了重要基础。尽管目前因浓度过低未能实现代谢物的质谱鉴定，但作者为未来的研究勾勒出了一条清晰的技术路线：通过使用更大规模的制备级SEC柱对大量唾液样本进行预富集，再结合正交色谱纯化步骤，最终有望通过LC-ESI-HR MS技术鉴定出这些神秘的LMW硒代谢物。这些代谢物可能包括已知的硒代氨基酸（如硒蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸）或硒代糖，也可能存在尚未被报道的新化合物。
总之，这项研究首次揭开了奶牛唾液中低分子量硒代谢世界的面纱，虽然未能完全揭秘其具体成分和生理调控机制，但为连接硒营养、唾液代谢与口腔微生物组健康这个全新的研究领域打开了大门，并提供了一套可行的分析策略。未来的研究需要在此方法学基础上，结合微生物组学与生物信息学工具，最终阐明硒在奶牛口腔微生态乃至整体健康中扮演的确切角色。
