(P)ppGpp合成酶Rsh通过调节由硫酸还原酶CysI介导的硫代谢，促进布鲁氏菌（Brucella abortus）中持久细胞（persister cells）的形成

《Veterinary Microbiology》：(P)ppGpp synthase Rsh Promotes Persister Cells Formation by Regulating Sulfur Metabolism Mediated by Sulfate Reductase CysI in Brucella abortus

持留菌形成机制研究中，发现布氏杆菌Δrsh菌株cysI基因显著下调，Rsh通过调控硫代谢关键酶CysI促进持留菌形成，其作用位点位于cysI基因上游122bp区域，cysI基因敲除株持留菌减少且硫化氢代谢受阻。

　　

刘晓芳|崔晨阳|王平平|王辉|翟云毅|杨远浩|陈家璐|刘伟|董铮|周东|金亚萍|王爱华

中国陕西省杨陵市西北农林科技大学兽医学院，邮编712100

摘要

持久细胞是一类休眠细胞亚群，它们对抗生素具有暂时性的耐受性，并与慢性感染相关。我们已经知道(p)ppGpp合成酶Rsh在布鲁氏菌（Brucella）暴露于利福平时促进持久细胞的形成，但Rsh通过何种代谢调控机制来促进持久细胞的形成尚不清楚。在这项研究中，我们首先对比了布鲁氏菌B. abortus A19（WT）株和Δrsh株在利福平暴露期间持久细胞形成的蛋白质组（proteome）和代谢组（metabolome）。我们发现，在持久细胞形成过程中，与硫代谢相关的蛋白质（NAD(P)/FAD依赖的亚硫酸盐还原酶cysI）在Δrsh株中显著下调（P < 0.01）。Rsh还显著影响了硫化氢的消耗（P < 0.01）。随后我们发现Rsh正向调控cysI基因，其启动子区域位于cysI基因上游122 bp处。此外，构建了cysI基因敲除株（ΔcysI），该株的持久细胞形成显著减少（P < 0.01），同时硫化氢的消耗也低于WT株。综上所述，我们首次报道了(p)ppGpp合成酶Rsh通过调控由亚硫酸盐还原酶CysI介导的硫代谢来促进布鲁氏菌B. abortus中的持久细胞形成。我们的结果为清除持久细胞以及预防布鲁氏菌感染提供了潜在的目标和新策略。

引言

布鲁氏菌属（Brucella spp.）是一种革兰氏阴性兼性胞内细菌，引起的布鲁氏菌病在许多国家和地区广泛流行，给畜牧业、生物安全和人类健康带来了极大的经济损失（Roop等人，2021年）。布鲁氏菌能够侵入宿主细胞并驻留在含有布鲁氏菌的囊泡（BCVs）中，这些囊泡与内吞和分泌途径的成分相互作用，确保细菌在宿主细胞中的存活（Yu等人，2024年）。布鲁氏菌在宿主细胞内进行细胞周期并持续存在，最终导致慢性感染（Alakavuklar等人，2023年）。布鲁氏菌引起的持续性感染对布鲁氏菌病的根除和控制构成了重大挑战（Myeni等人，2013年）。除了宿主相关因素外，布鲁氏菌引起的持续性感染机制还可能与抗生素耐药性和持久细胞有关。

持久细胞是一类表型转换的亚群，它们在高剂量抗生素暴露下能够存活而不发生基因变化，这种现象几乎存在于所有病原体中，并可能与某些病原体引起的持续性感染有关（Niu等人，2024年）。这种现象不仅在细菌中得到了广泛研究，也在真菌（Ke等人，2024年）和寄生虫（Jorge等人，2020年）中被发现，使用常规抗生素难以根除它们。目前，细菌持久细胞的分子机制仍不完全清楚。主要在大肠杆菌和其他模式细菌中进行的大量研究表明，多种因素与细菌持久细胞的形成有关（Roy等人，2024年）。研究表明，毒素-抗毒素系统（Xiang等人，2024年）、代谢（Li等人，2023年）、营养限制氧化应激（Zhang等人，2023年）、一般应激反应（Ronneau等人，2023年）以及第二信使分子(p)ppGpp都与细菌持久细胞的形成有关（Tkachenko等人，2021年）。然而，驱动持久细胞形成的机制并非由单一因素决定，而是涉及一个复杂的调控网络，该网络控制多个基因的表达以促进细菌持久细胞的形成。

第二信使(p)ppGpp在营养匮乏和其他应激条件下触发严格反应，调节细菌的生理和代谢过程以维持其存活（Winther等人，2018年）。相关研究表明，(p)ppGpp在细菌持久细胞的形成中起着重要的调控作用，例如在大肠杆菌和铜绿假单胞菌（Svenningsen等人，2019年）中。在布鲁氏菌中，(p)ppGpp由RelA/SpoT同源物（Rsh）合成（Das和Bhadra，2020年）。在我们之前的研究中，已经证明布鲁氏菌B. abortus能够形成持久细胞，并且(p)ppGpp合成酶Rsh在利福平存在下促进其持久细胞的形成（Liu等人，2023年）。我们还展示了(p)ppGpp合成酶Rsh促进持久细胞形成的部分调控机制，该机制与布鲁氏菌中的ATP水平有关（Liu等人，2024年）。

硫代谢指的是生物体内与硫相关的各种生化过程，包括硫的获取、转化、利用和硫相关代谢途径（Tang等人，2025年）。硫代谢途径中的关键代谢物包括硫化氢（H?S）、硫酸盐（SO?2?）和半胱氨酸。这些代谢物在调节细菌能量代谢、DNA修复和应激反应中起着重要作用（Miller和Schmidt，2020年）。在这项研究中，我们试图探讨Rsh影响布鲁氏菌B. abortus中持久细胞的潜在代谢调控机制。我们整合并分析了野生型（WT）株和Δrsh株在利福平处理期间持久细胞的蛋白质组和代谢组库。我们发现，与WT株相比，Rsh在持久细胞形成过程中影响了许多差异表达的蛋白质和富集的代谢途径。

具体来说，我们发现(p)ppGpp合成酶Rsh通过调控布鲁氏菌B. abortus中的亚硫酸盐还原酶CysI来促进持久细胞的形成。

部分内容片段

细菌及培养条件

B. abortus A19菌株由陕西省兽药监督研究所提供。所有关于B. abortus菌株的实验均在生物安全等级2的设施中进行。所有缺失菌株均来源于野生型B. abortus A19（WT）。所有布鲁氏菌菌株均在37°C下，在Tryptic Soy Broth（TSB）液体培养基中以180转/分钟的转速摇匀培养，或在固体TSA培养基上培养。大肠杆菌（DH5α和BL21）在37°C下，在Luria-Bertani（LB）液体培养基中以180转/分钟的转速摇匀培养，或在固体LA培养基上培养。

WT和Rsh突变体之间的蛋白质定性数据质量控制和重复性分析

rsh on the formation of persistent cells in Brucella abortus, we first performed proteomic analysis between WT and Δrsh. These results showed that a total of 34,544 peptides and 2,424 proteins were identified across three biological replicates between WT and Δrsh strains using Data-Independent Acquisition (DIA) analysis (Fig. 1 A, B). The coefficient of variation (CV) plots and principal component analysis (PCA) plots of the proteomic data demonstrated high

qRT-PCR验证

rsh strains in Brucella. These results revealed that Rsh is associated with multiple metabolic pathways during the formation of persistent cells in B. abortus. We selected a total of 4 differential proteins for quantitative real-time PCR (qRT-PCR) validation. Our results showed that the Δrsh strain exhibited

讨论

大多数细菌病原体都是能够永久定植于宿主体内并建立慢性或复发性感染的微生物，免疫系统和抗菌疗法难以将其清除。持久细胞被认为是导致治疗失败和感染复发的主要原因（Niu等人，2024年）。持久细胞是一类细菌细胞的亚群，具有

结论

本研究证明，(p)ppGpp合成酶Rsh通过调控硫代谢来促进布鲁氏菌B. abortus中的持久细胞形成。整合组学分析显示，Rsh上调了硫酸盐还原酶CysI并增强了硫化氢（H?S）的产生。此外，Rsh正向调控cysI基因的启动子，其核心区域位于编码序列上游122 bp处。删除cysI基因显著减少了持久细胞的形成和H?S的水平。我们确认了Rsh的作用

资助

CRediT作者贡献声明

杨远浩：方法学、研究、数据分析。翟云毅：软件、方法学、研究。刘伟：数据分析、数据管理。陈家璐：方法学、研究、软件、资源管理、数据分析。崔晨阳：监督、软件、资源管理、方法学、研究、数据分析。王爱华：撰写-审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。刘晓芳：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、监督、软件、方法学

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