《Virologica Sinica》：Phloretin targeting the 3CLpro Cys144 exhibits broad-spectrum antiviral activity against swine enteric coronavirus
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针对猪肠道冠状病毒(SECoVs)感染导致仔猪高死亡率、疫苗免疫存在缺口且缺乏广谱药物的难题，本研究通过分子对接与分子动力学模拟筛选天然化合物库，发现根皮素(phloretin)可靶向结合并抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及猪丁型冠状病毒(PDCoV)的3C样蛋白酶(3CLpro)保守位点Cys144，在体内外均展现出良好的预防和治疗效果。通过基于构效关系的结构优化，所得衍生物A12的抗病毒活性显著提升。该研究为开发广谱抗冠状病毒药物提供了新策略和候选分子。
在生猪养殖业中，一场看不见的“肠道风暴”每年都在造成巨大的经济损失。这场风暴的元凶是猪肠道冠状病毒，它是一个包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒和猪丁型冠状病毒在内的病毒家族。感染了这些病毒的哺乳期仔猪会出现急性水样腹泻、呕吐、脱水等症状，死亡率可接近100%，给全球养猪业带来了严峻挑战。传统的防控手段主要依赖灭活疫苗和弱毒疫苗，然而，病毒频繁的突变导致抗原漂移，使得传统疫苗的保护效力大打折扣。更棘手的是，不同种类的猪肠道冠状病毒之间缺乏交叉中和活性，这意味着养殖场可能需要为不同的病原体接种多种疫苗，极大地增加了免疫成本。面对疫苗保护因病毒频繁突变和交叉中和能力不足而受限的现实，开发针对病毒保守蛋白的广谱抗病毒药物，成为了填补免疫缺口的关键治疗策略。
本研究旨在开发一种能够广谱抑制猪肠道冠状病毒的药物。研究人员运用了分子对接、分子动力学模拟、体外细胞实验、体内动物模型实验、生物膜干涉技术、荧光共振能量转移分析以及基于构效关系的药物化学设计等关键技术方法。体外研究使用Vero E6和ST细胞系以及PEDV、TGEV、PDCoV病毒株；体内研究则使用了BALB/c小鼠进行急性毒性测试，并以3日龄无初乳仔猪建立了病毒感染与药物治疗模型。
2.1. 根皮素与猪肠道冠状病毒3CLpro稳定结合
通过分子对接针对PEDV、TGEV和PDCoV的3CLpro筛选天然小分子化合物库，发现根皮素的结合评分最高。分子动力学模拟显示，根皮素与三种病毒的3CLpro复合物在100 ns模拟时间内均保持稳定，表明根皮素能与三种3CLpro形成稳定结合，是一种潜在的广谱抗猪肠道冠状病毒药物。
2.2. 根皮素在体外抑制猪肠道冠状病毒复制
细胞实验表明，根皮素能剂量依赖性地降低PEDV、TGEV和PDCoV的病毒蛋白表达水平、病毒mRNA拷贝数和病毒滴度。间接免疫荧光实验也证实了根皮素的抗病毒效果。其选择性指数均大于10，显示出治疗潜力。进一步的实验发现，根皮素主要通过抑制病毒的复制阶段来发挥抗病毒作用，而对病毒的吸附、内化和释放阶段无显著影响。
2.3. 根皮素缓解仔猪感染猪肠道冠状病毒的临床症状
小鼠急性毒性实验确定了根皮素的安全剂量，并据此换算得到仔猪的给药剂量。在仔猪模型中，无论是预防性给药还是治疗性给药，根皮素均能显著提高感染PEDV、TGEV和PDCoV的仔猪存活率，改善腹泻症状和临床体征，并减轻体重下降。
2.4. 根皮素抑制猪肠道冠状病毒复制和排毒
根皮素的预防和治疗能显著降低感染仔猪空肠和回肠中的病毒载量，改善由病毒感染引起的肠壁变薄、肠管肿胀充血等病理变化，并减少肠道绒毛萎缩。免疫荧光显示病毒抗原检测降低。同时，根皮素还能显著减少感染后24-48小时内粪便中的病毒排放量。
2.5. 根皮素与猪肠道冠状病毒3CLpro的结合及活性抑制
通过生物膜干涉技术证实根皮素与三种病毒的3CLpro具有强亲和力。荧光共振能量转移实验表明，根皮素能浓度依赖性地抑制3CLpro的酶活性，其半数抑制浓度在22.6至27.2 μM之间。这证明根皮素通过直接靶向3CLpro发挥广谱抑制猪肠道冠状病毒的作用。
2.6. Cys144突变降低了根皮素与猪肠道冠状病毒3CLpro的亲和力
通过分子对接预测和点突变结合生物膜干涉技术分析，发现将PEDV、TGEV和PDCoV的3CLpro的Cys144位点突变为丙氨酸后，根皮素与突变体蛋白的亲和力下降了超过1000倍，而其他位点的突变则影响不大。分子对接模拟显示，Cys144突变导致结合相互作用减弱或丢失。这表明Cys144是根皮素与三种病毒3CLpro相互作用的关键位点。
2.7. 根皮素的结构优化与衍生物药效
为了提高根皮素的广谱抗病毒活性，研究人员基于其与3CLpro的结合模式，对根皮素的结构进行了化学修饰，设计合成了12个衍生物。其中，衍生物A12（在苯环对位引入三氟甲氧基）表现出最强的抗病毒活性，其对PEDV、TGEV和PDCoV的抑制效果相比根皮素分别提高了15.7倍、2.6倍和8.4倍，选择性指数也显著提高。酶活抑制和亲和力实验均证实A12对3CLpro的抑制作用和结合能力更强。
该研究得出结论，根皮素通过靶向猪肠道冠状病毒3CLpro的保守氨基酸位点Cys144，在体内外均发挥出广谱抗病毒活性，且兼具预防和治疗效果。基于构效关系的结构修饰成功获得了活性显著提升的衍生物A12。这项工作揭示了针对3CLpro保守位点Cys144的广谱靶向策略，为开发应对猪肠道冠状病毒感染的广谱抗病毒药物提供了先导化合物和设计范式，对弥补疫苗免疫缺口、控制冠状病毒在养殖场的传播具有重要的理论和应用价值。该研究论文发表于《Virologica Sinica》。
