《Gut Microbes》：Bacterial constipation: Mucin-degrading intestinal commensal bacteria cause constipation
引言
便秘，定义为每周排便少于三次，是一种常见的胃肠道疾病。它通常由结肠传输延长、直肠排空受损或盆底功能障碍导致，由于过度水分吸收而形成坚硬、干燥的粪便。便秘常见于神经退行性疾病如帕金森病（Parkinson‘s disease, PD）和功能性疾病如慢性特发性便秘（chronic idiopathic constipation, CIC）。在PD中，便秘常先于运动症状10至20年出现。然而，多巴胺能疗法和外周作用的DOPA脱羧酶抑制剂对肠道功能障碍益处甚微，这表明PD相关便秘可能涉及多巴胺能神经变性之外的机制。在CIC中，传统的泻药或促动力药无法提供持久的症状缓解。这些治疗局限性凸显了探索便秘背后替代机制的必要性，肠道微生物群的作用日益受到关注。
值得注意的是，嗜黏蛋白阿克曼菌（A. muciniphila）丰度的增加在不同国家的PD患者中均有报道。A. muciniphila也与粪便更硬、结肠传输减慢相关，并且在便秘队列中其丰度与肠道菌群失调有关。同样，拟杆菌属（Bacteroides）物种在便秘患者的结肠黏膜中被报道丰度较高。这些观察共同提出了肠道微生物组成和功能可能同时参与PD和CIC便秘的可能性。
黏蛋白是一种糖蛋白，形成结肠黏液层。它在保护肠道内衬和通过形成凝胶状屏障来维持水分方面起着至关重要的作用。与胃和小肠不同，结肠黏蛋白携带末端硫酸盐。虽然已有报道CIC患者胃黏蛋白减少，但便秘中的结肠黏蛋白水平尚未被探索。此外，肠道细菌代谢结肠黏蛋白对便秘的影响尚未在人类或动物模型中进行研究。这些观察提出了特定微生物功能，而非单纯的动力缺陷，可能是一部分患者便秘的基础。
肠道微生物群可以通过分解黏蛋白聚糖来改变黏液结构，这可能改变黏液屏障的完整性和组成。其中，A. muciniphila和拟杆菌属（Bacteroides spp.）是参与黏蛋白代谢的两个主要细菌类群。然而，A. muciniphila无法降解硫酸化的结肠黏蛋白，因为它缺乏从黏蛋白寡糖上解离末端硫酸盐所必需的硫酸酯酶。相比之下，拟杆菌属，特别是多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron），作为人类粪便中拟杆菌属的主要物种之一，拥有多功能的聚糖降解能力，包括结肠黏蛋白。值得注意的是，一些拟杆菌属表达硫酸酯酶，这允许去除末端硫酸盐残基，从而促进后续的黏蛋白聚糖降解。由于脱硫酸化可能是黏蛋白降解的限速步骤，我们假设拟杆菌介导的黏蛋白脱硫酸化通过使其能够接触黏蛋白，从而增强了其他肠道微生物（包括A. muciniphila）的糖苷酶活性。这种协同的黏蛋白裂解可能加速黏液分解并促进便秘的发生。
本研究通过结合人类微生物群分析与无菌小鼠模型来验证这一假设。
材料与方法
人类和动物研究均获得相关伦理审查委员会的批准。参与者包括PD患者、CIC患者和健康对照。CIC患者为本研究新招募。所有CIC患者均进行了血液检查和结肠镜检查以确保无任何器质性疾病，但PD患者未进行。粪便样本在参与者家中收集并运送至实验室。DNA从冻干粪便中提取。使用针对V3-V4高变区的引物进行16S rRNA基因测序。通过水解探针定量实时PCR（qPCR）测定细菌计数。
使用洛哌丁胺（loperamide）诱导的便秘模型在SPF野生型小鼠中建立。还建立了使用缺乏纤维的AIN93M饮食的便秘模型。通过口服灌胃单一厌氧菌培养液（OD600≈0.7）创建无菌小鼠和限菌小鼠。通过同源重组敲除B. thetaiotaomicron中的厌氧硫酸酯酶成熟酶（anaerobic sulfatase-maturating enzyme, anSME）基因，生成ΔanSME突变株。使用粪便黏蛋白测定试剂盒定量粪便黏蛋白含量。对小鼠粪便样本和结肠组织进行荧光染色。对小鼠结肠组织和细菌进行RNA-seq分析。使用代谢笼评估小鼠的代谢活动。通过经直肠给予FITC-葡聚糖评估肠道通透性。使用GraphPad Prism 10进行统计分析。
结果
A. muciniphila和B. thetaiotaomicron在帕金森病（PD）和慢性特发性便秘（CIC）患者中增加，粪便黏蛋白减少
我们收集了231名PD患者、54名CIC患者和147名健康对照者的粪便样本。布里斯托大便性状量表显示，PD和CIC患者的粪便比对照更硬。排便频率在PD和CIC中低于对照。粪便水分含量在PD中较低，但在CIC与对照之间无显著差异。然而，当受试者分为便秘（<每周3次排便）和非便秘亚组时，所有组中便秘亚组的粪便水分含量均显著较低。粪便黏蛋白含量在PD中较低，但在CIC与对照之间无显著差异。将受试者分为便秘和非便秘亚组后，PD和CIC的便秘亚组粪便黏蛋白含量显著较低。两因素方差分析显示，便秘对粪便黏蛋白含量的影响显著，而疾病（对照、PD或CIC）的影响不显著，表明黏蛋白减少与便秘的关系比与疾病本身更密切。
通过16S rRNA测序和qPCR分析均显示，与对照相比，CIC和PD中阿克曼菌属（Akkermansia）丰度增加。A. muciniphila是人类粪便中阿克曼菌属的主要且特征明确的物种。尽管最近的宏基因组分析揭示了人类粪便中存在其他阿克曼菌物种，但我们在后续分析中聚焦于A. muciniphila。将样本按A. muciniphila丰度分为低和高两组，高A. muciniphila的个体具有较低的水分和黏蛋白含量。同样，在对照和PD中，便秘受试者的A. muciniphila高于非便秘受试者，但在CIC中无此差异。
我们通过qPCR定量了七种实验证明的聚糖裂解肠道细菌的相对丰度。结果显示，A. muciniphila和B. thetaiotaomicron在PD和CIC中均显著增加。
移植A. muciniphila的无菌小鼠未出现便秘
因此，我们假设A. muciniphila的增加可能导致黏蛋白减少并进而导致便秘。为验证此假设，我们建立了移植A. muciniphila的限菌小鼠模型。然而，这些限菌小鼠仅表现出轻微的便秘表型，粪便颗粒计数和粪便水分含量略有降低。这与先前一项研究结果一致，该研究显示正常饮食下移植A. muciniphila的无菌小鼠同样缺乏便秘。由于A. muciniphila无法降解硫酸化的结肠黏蛋白，主要觅食其他黏液聚糖（特别是胃黏蛋白），我们接下来寻找结肠黏蛋白降解细菌。文献检索确定了七种实验证明能降解结肠黏蛋白的细菌。qPCR定量这七种细菌的相对丰度显示，A. muciniphila和B. thetaiotaomicron在PD和CIC中均显著增加。
洛哌丁胺诱导的便秘未能增加A. muciniphila
为了评估在PD和CIC患者中观察到的A. muciniphila和B. thetaiotaomicron增加是便秘的原因还是后果，我们在SPF野生型小鼠中使用洛哌丁胺建立了药物诱导的便秘模型。洛哌丁胺减少了粪便输出，确认了便秘诱导。在我们的小鼠粪便样本中检测到的四种聚糖裂解细菌中，B. thetaiotaomicron在洛哌丁胺治疗后相对丰度显著增加。相比之下，A. muciniphila在组水平上未表现出统计学显著变化，尽管一些小鼠显示出丰度增加。
为了检查洛哌丁胺是否直接影响细菌生长，我们在存在0.0、0.1、1.0和10 μM洛哌丁胺的条件下进行了A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的体外生长测定。洛哌丁胺抑制了A. muciniphila的生长，但不抑制B. thetaiotaomicron的生长。因此，结肠浓度可能太低而无法抑制A. muciniphila的生长。或者，洛哌丁胺抑制了生长，但未确定的便秘相关因子可能补偿了这种抑制效应。
我们还使用缺乏纤维的AIN93M饮食建立了另一个便秘模型。纤维剥夺对A. muciniphila或B. thetaiotaomicron的丰度没有影响。
在洛哌丁胺诱导和纤维剥夺便秘小鼠模型中A. muciniphila未增加，这指向一个观点：其在PD和CIC患者中的富集不太可能是便秘的次要后果，而可能因果性地促进黏液降解和便秘的发展。
我们接下来询问泻药使用是否可以解释观察到的细菌变化。然而，我们发现泻药使用依赖于疾病状态（对照、CIC或PD），调整后的Cramer‘s V值为0.459，泻药无法作为评估对细菌丰度影响的独立变量进行操作。我们另外询问对泻药的反应性是否影响细菌变化。因此，我们将分析限制在使用泻药的CIC患者，并将他们分为无反应者（<每周3次排便）和反应者。A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的丰度在两组之间没有统计学差异，表明泻药反应性不太可能解释CIC患者中这些物种丰度的增加。
移植A. muciniphila和B. thetaiotaomicron两者的无菌小鼠出现便秘
我们接下来通过移植A. muciniphila和B. thetaiotaomicron两者（A.m. & B.t. 小鼠）创建了共定植小鼠，并将它们与单独移植A. muciniphila或单独移植B. thetaiotaomicron的单一定植小鼠进行比较。每克粪便中A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的拷贝数在单定植和共定植小鼠之间相似，表明在所有组中定植稳定。对照限菌小鼠移植了改变的谢德勒菌群（Altered Schaedler Flora, ASF），其由八种确定的细菌组成。我们发现A.m. & B.t. 小鼠的粪便黏蛋白含量降低。尽管A.m. 小鼠的粪便黏蛋白水平低于ASF小鼠，但差异不具统计学显著性。通过WGA、UEA1和抗Muc2抗体对粪便黏蛋白进行荧光染色进一步证实了A.m. & B.t. 小鼠粪便黏液水平降低。相比之下，A.m. 小鼠的染色与ASF对照没有显著差异，尽管视觉上明显减少。
我们接下来确认，减少的粪便黏蛋白并非由于无菌小鼠结肠上皮细胞的黏蛋白产生减少。对单定植（A.m. 或B.t.）和共定植（A.m. & B.t.）小鼠结肠组织的RNA测序分析显示，包括Muc2在内的六个黏蛋白基因、四个黏蛋白分泌基因和18个糖基转移酶基因的表达在三组之间没有统计学差异。此外，结肠杯状细胞的数量和面积在三组无菌小鼠之间没有差异。因此，共定植小鼠中粪便黏蛋白水平的降低主要归因于细菌增强的黏蛋白降解活性。
正如预期，使用代谢笼进行的粪便分析显示，与单定植A.m. 或B.t. 的小鼠或ASF小鼠相比，A.m. & B.t. 小鼠的粪便颗粒更少、粪便湿重更低、粪便水分含量降低。相比之下，食物摄入量、水摄入量和尿量在各组中均保持不变，这使得系统性脱水不太可能成为便秘的原因。通过经直肠给予FITC-葡聚糖（10 kDa）检查肠道通透性。三小时后，仅在A.m & B.t. 小鼠中血浆FITC-葡聚糖水平增加，表明结肠黏液层可能变薄。因此，A. muciniphila和B. thetaiotaomicron的共移植增强了黏液觅食，导致粪便水合和润滑减少以及肠道通透性增加，最终导致便秘。
与A.m. & B.t. 小鼠相比，A.m. 小鼠中硫酸盐同化途径的基因增加
我们接下来探讨为何黏液降解在A.m. & B.t. 小鼠中增强，而在A.m. 小鼠中没有。为此，对粪便进行RNA-seq分析，比较A.m. 和A.m. & B.t. 小鼠中A. muciniphila编码的2354个基因的表达。正如预期，RNA-seq读数未比对到B. thetaiotaomicron基因，因为此类基因在A.m. 小鼠中应该不存在。主成分分析显示，在A.m. 和A.m. & B.t. 小鼠中表达的基因形成了不同的簇。使用基因本体生物过程进行超几何检验的途径分析显示，与A.m. & B.t. 小鼠相比，硫酸盐同化以及涉及硫的其他三个生物合成过程是A.m. 小鼠中最富集的前四个途径。同样，检查A. muciniphila中与硫代谢相关的14个基因发现，与A.m. & B.t. 小鼠相比，其中6个基因在A.m. 小鼠中显著增加。这14个基因中的12个位于KEGG数据库中的同化硫酸盐还原途径及其辅助链烷磺酸盐途径中。对这些途径中基因表达倍数变化进行颜色编码显示，除了ssuA和ssuC外，这些途径中的所有基因在A.m. 小鼠中相较于A.m. & B.t. 小鼠均增加。这些途径是细菌硫同化机制的一部分，使A. muciniphila能够将无机或替代硫源纳入生物分子。然而，重要的是要注意这些途径在功能上不同于硫酸酯酶活性，后者是从复杂硫酸化聚糖（如结肠黏蛋白）上水解裂解硫酸盐部分所必需的。A.m. 小鼠中硫酸盐同化途径增加的一种可能解释是，硫酸盐同化基因上调以补偿硫酸盐的缺乏。或者，在缺乏B. thetaiotaomicron的情况下硫酸盐的缺乏可能过度刺激了宿主肠道上皮细胞为A. muciniphila提供足够量的硫酸盐。
B. thetaiotaomicron中硫酸酯酶的活化是导致A.m. & B.t. 小鼠便秘的关键
我们接下来询问硫酸酯酶是否确实是A.m. & B.t. 小鼠中降解粪便黏蛋白的关键。B. thetaiotaomicron中的厌氧硫酸酯酶成熟酶（anSME）对于硫酸酯酶的翻译后活化至关重要。anSME是一种自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶，催化半胱氨酸或丝氨酸残基翻译后修饰为Cα-甲酰甘氨酸。这种修饰对于激活硫酸酯酶是必需的，这使得细菌如B. thetaiotaomicron能够降解硫酸化聚糖，包括黏蛋白O-聚糖，并将其用作营养来源。先前的报告显示，敲除B. thetaiotaomicron中的anSME会导致硫酸酯酶活性丧失，并损害利用硫酸化多糖作为碳源的能力。因此，我们通过同源重组敲除了B. thetaiotaomicron中编码anSME的基因。我们通过在硫酸化聚糖（硫酸软骨素或肝素）作为唯一碳源的条件下培养它们，证实了ΔanSME菌株缺乏硫酸酯酶。正如预期，ΔanSME菌株可以在含有0.5%葡萄糖的最小培养基中生长，但不能在含有0.5%硫酸软骨素或0.5%肝素的培养基中生长。这些结果表明anSME对于硫酸化糖胺聚糖的降解和利用是必需的。
然后，我们创建了移植A. muciniphila野生型菌株和B. thetaiotaomicron的anSME缺陷型菌株的限菌小鼠（A.m. & B.t.ΔanSME小鼠）。粪便样本中细菌基因组拷贝数的定量显示，ΔanSME菌株能够定植到与野生型菌株相似的水平，表明anSME的缺失不影响B. thetaiotaomicron的定植。我们发现野生型和ΔanSME菌株之间的粪便定植水平没有统计学显著差异，表明ΔanSME突变体保留了与野生型菌株相当的定植能力。通过代谢笼和冻干机评估便秘发现，与A.m. & B.t. 小鼠相比，A.m. & B.t.ΔanSME小鼠的粪便颗粒计数和水分含量均增加。同样，A.m. & B.t.ΔanSME小鼠的粪便黏蛋白含量增加，肠道通透性降低。这些结果表明，由anSME激活的硫酸酯酶对于A.m. & B.t. 小鼠中有效的黏蛋白降解是必需的。因此，B. thetaiotaomicron中功能性硫酸酯酶的缺乏导致黏液降解受损，保留了粪便水合和肠道通透性，从而保护了A.m. & B.t.ΔanSME小鼠免于发生便秘。
讨论
对PD、CIC和对照的宏基因组分析，以及对七种黏蛋白降解细菌的qPCR结果，均指出A. muciniphila和B. thetaiotaomicron是与便秘相关的候选细菌。尽管最近在阿克曼菌属中鉴定出了其他物种，但A. muciniphila是人类肠道中的优势物种。A. muciniphila的增加与先前报道的肠道传输时间慢的患者中16S rRNA测序数据一致。携带单独A. muciniphila或单独B. thetaiotaomicron的限菌小鼠未能发展出便秘。我们的A.m. 小鼠缺乏便秘与先前一项报告一致，该报告显示携带A. muciniphila的无菌小鼠对肠道黏蛋白没有影响。A. muciniphila能够觅食具有末端唾液酸和岩藻糖残基的黏蛋白，但不能觅食具有末端硫酸盐的黏蛋白。由于结肠黏蛋白富含末端硫酸盐，A. muciniphila很可能未能消化结肠黏蛋白。相比之下，同时移植两种细菌的限菌小鼠（A.m. & B.t. 小鼠）发展出便秘。由于B. thetaiotaomicron提供硫酸酯酶以去除结肠黏蛋白的末端硫酸盐，A. muciniphila能够完全降解结肠黏蛋白并在A.m. & B.t. 小鼠中诱发便秘。先前一项研究显示，移植一组由14种细菌组成的合成菌群的无菌小鼠在纤维剥夺饮食下表现出黏液层变薄。由于这14种细菌中包括了A. muciniphila和B. thetaiotaomicron，这两种细菌很可能对黏液层变薄产生了实质性影响。
对A.m. & B.t. 和A.m. 小鼠中A. muciniphila编码基因的粪便RNA-seq分析揭示，与A.m. & B.t. 小鼠相比，硫酸盐同化途径在A.m. 小鼠中上调。尽管A.m. 小鼠中上调的硫酸盐同化途径完全出乎意料，但我们接下来检查了B. thetaiotaomicron中的硫酸酯酶是否确实是导致A.m. & B.t. 小鼠便秘的关键。因此，我们通过同源重组删除了B. thetaiotaomicron中硫酸酯酶成熟所必需的基因anSME。正如预期，A.m. & B.t.ΔanSME小鼠与A.m. & B.t. 小鼠相比，便秘程度更轻，粪便黏蛋白含量增加，肠道通透性降低。B. thetaiotaomicron中的硫酸酯酶可能对A. muciniphila产生影响。首先，正如反复陈述的，硫酸酯酶去除结肠黏蛋白的末端硫酸盐，使得A. muciniphila能够觅食结肠黏蛋白。其次，硫酸酯酶为A. muciniphila提供硫酸盐，硫酸盐被还原为硫化物以合成L-半胱氨酸及其下游含硫分子。脱硫弧菌属（Desulfovibrio spp.）是硫酸盐还原菌，需要硫酸盐进行生长，因为它们通过异化硫酸盐还原利用硫酸盐作为其能量代谢的末端电子受体。与A. muciniphila类似，脱硫弧菌属依赖于其他细菌产生的硫酸盐。有趣的是，A. muciniphila和脱硫弧菌属在PD患者中均有增加。B. thetaiotaomicron（其在PD患者中也增加）提供充足的硫酸盐，可能部分解释了A. muciniphila和脱硫弧菌属的增加。
A. muciniphila是一种黏蛋白专性细菌，能够使用宿主来源的黏蛋白作为其唯一碳源。相比之下，硫酸酯酶并非B. thetaiotaomicron所独有。其他细菌包括拟杆菌属中的B. caccae和B. uniformis也能够产生硫酸酯酶，并可以替代B. thetaiotaomicron提供硫酸酯酶。提供硫酸酯酶细菌的冗余也支持了A. muciniphila是驱动黏液消耗的关键细菌的观点，尽管其完全功能需要协作细菌。
我们的研究存在以下局限性。首先，尽管CIC常先于PD发生，我们假设CIC和PD患者中有一部分具有相似的便秘细菌起源。我们确实发现A. muciniphila和B. thetaiotaomicron在CIC和PD中均增加。然而，其他未确定的细菌也可能发挥类似的便秘诱导效应。第二，对照、PD和CIC的样本量不匹配。PD患者的大样本量容易产生统计学显著性，而CIC患者的小样本量则不能。我们认为这是探索性临床研究中普遍认识的局限性。第三，我们无法对人类样本进行粪便黏蛋白和Muc2蛋白的免疫组化分析，因为冷冻粪便样本未能保持微观完整性。相反，我们量化了人类样本中黏蛋白来源的O-聚糖，并发现在便秘患者以及A. muciniphila丰度较高的患者中，它们确实减少了。最后，虽然我们展示了A. muciniphila和B. thetaiotaomicron协同诱导结肠黏蛋白的脱硫酸化和降解并诱发便秘，但由于技术困难，我们或他人都未在便秘患者的粪便样本中量化硫酸化聚糖和黏蛋白降解活性。然而，人类粪便样本的鸟枪法宏基因组分析与我们的小鼠观察结果一致。首先，在伴有快速眼动睡眠行为障碍的PD患者中，微生物CAZyme库偏向于黏蛋白降解而非膳食纤维降解，且黏蛋白降解类群增加。第二，在大型PD患者队列中，降解硫酸化黏蛋白聚糖的硫酸酯水解酶（KEGG Orthology: KO1138, EC 3.1.6）的基因增加。
总之，我们表明A. muciniphila是便秘发生的关键细菌，而另一种提供硫酸酯酶的细菌在其发展中扮演辅助但不可或缺的角色。两种细菌协同消耗结肠黏蛋白，继而减少水分保留和黏液润滑。我们的研究提示人类中存在细菌性便秘。A. muciniphila的粪便丰度可作为识别此类患者的生物标志物。此外，噬菌体介导的细菌抑制或阻断细菌硫酸酯酶的小分子可能保持结肠黏液完整性，改善粪便水合，并缓解这些患者的便秘。
