《Gut Microbes》：Children’s gut microbiota predicts the efficacy of obesity treatment
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本研究探索了儿童肥胖干预中，个体化治疗策略的生物预测因子。基于一项纵向临床研究，该论文系统分析了基线肠道菌群多样性（如香农指数(Shannon index)、辛普森指数(Simpson index)）及特定菌属（如粪杆菌属(Faecalibacterium)）丰度与干预后代谢评分(MetScore)和体重指数Z分数(BMI z-score)改善之间的关联。研究发现，基线菌群多样性越高，以及特定有益菌丰度越高，预示着生活方式干预的代谢和减重效果越好。随机森林(Random Forest)预测模型表现出高准确度（AUC > 0.87）。这为利用肠道菌群特征指导儿童肥胖的个性化精准治疗提供了新的科学依据。
引言
饮食习惯与体力活动是影响肥胖发展的最重要可改变因素之一。因此，针对成人与儿童肥胖的治疗与预防工作，主要聚焦于包含旨在降低体重、改善代谢健康的饮食建议在内的生活方式项目。然而，治疗反应存在显著的个体间差异。这种差异性突显了个性化营养的重要性，其旨在通过考虑可能影响干预反应性的宿主特异性及外部因素，为个体或群体量身定制肥胖干预方案。
肠道菌群参与人体众多功能，包括能量提取、宿主免疫与代谢调节。因此，它被认为是肥胖及其相关合并症发展中的重要参与者。特定的肠道菌群特征，例如低细菌丰富度或阿克曼氏菌(Akkermansia)丰度降低，与肥胖相关心脏代谢疾病的易感性相关。多项在成人和儿童中进行的研究探讨了饮食调整如何影响肠道菌群组成，从而有助于减轻肥胖相关的代谢风险因素。例如，坚持地中海饮食可增加有益类群如普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、真杆菌属(Eubacterium)和罗斯氏菌属(Roseburia)的丰度，这些菌群与炎症标志物呈负相关。同样，在儿童中，高纤维饮食干预促进了特定粪杆菌属(Faecalibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和梭菌属(Clostridium)菌株的生长，同时降低了拟杆菌属(Bacteroides)的水平，凸显了饮食对菌群组成的强大影响。
然而，肠道菌群在营养吸收、能量储存和从食物摄入中获取能量方面也发挥着重要作用。近期研究发现，个体对饮食干预的反应可能受预先存在的菌群组成影响。在儿科人群中，特定肠道微生物组特征与肥胖儿童代谢相关脂肪性肝病(MASLD)和代谢相关脂肪性肝炎(MASH)的进展相关。计算模型的进步使得整合生物学数据与微生物谱以预测个体对特定干预的反应成为可能。例如，一项纳入800名成年人队列的人体测量变量、饮食习惯、体力活动、血液参数和肠道菌群数据的综合研究表明，将肠道菌群谱纳入人体测量、生活方式和生化参数，显著提高了机器学习算法预测餐后血糖反应的准确性。类似地，微生物丰富度和基线肠道菌群组成已被证明可以预测肥胖成人减重干预的有效性，观察到与炎症谱改善和腰围减少均存在关联。此外，特定类群如嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的存在与热量限制后的有利代谢结果相关。
这些发现强调了肠道菌群作为预测饮食和生活方式干预反应的重要生物标志物的作用，此类干预旨在改善肥胖和代谢健康。迄今为止，有限的研究探讨了肠道菌群组成是否可以预测儿童和青少年营养干预的有效性。考虑到儿童和青少年时期肠道微生物组的动态发展，了解其在调节干预结果中的作用，可能对在这些年龄组中实现肥胖管理的个性化至关重要。因此，本研究旨在调查在肥胖儿童和青少年队列中，肠道菌群组成是否可以作为对结构化减重干预反应性的预测标志物。
材料与方法
本研究为一项纵向观察性研究，是对一项分析儿童肥胖减重干预的随机临床试验的二次分析。本研究包括成功完成Obemat2.0临床试验并参与Microbekids研究的参与者的基线和最终人体测量、生化测量以及基线肠道菌群组成。
共有41名肥胖儿童（8-14岁）被纳入最终分析。肥胖定义为体重指数(BMI) ≥ 第97百分位数。干预组接受为期12（+3）个月的结构化多组分干预，包括11次访视，涵盖肥胖信息、食品购物指导、饮食平衡、健康菜单规划、体力活动、焦虑管理策略、健康生活习惯、早餐和午后点心建议、份量控制以及午餐和晚餐的均衡分配等主题。对照组则接受基于西班牙国家卫生系统《儿童和青少年肥胖预防和治疗临床实践指南》的建议。
在基线和最终评估时，测量了人体测量学指标（体重、身高、腰围、BMI、BMI z分数）、血压以及生化参数（高密度脂蛋白胆固醇(HDL-cholesterol)、甘油三酯、葡萄糖、胰岛素，并计算了胰岛素抵抗稳态模型评估(HOMA-IR)）。所有参数均根据参考数据标准化为z分数。心脏代谢风险评分(MetScore)计算为一个连续变量，通过求和标准化后的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、甘油三酯、HOMA-IR、腰围和HDL-cholesterol的z分数得出（HDL-cholesterol z分数乘以-1）。较高的MetScore值表示较不理想的心脏代谢状况。
在基线收集粪便样本，提取DNA，针对16S rRNA基因的V3-V4可变区进行测序。使用QIIME2流程和DADA2进行数据分析，并利用Silva v138数据库进行物种分类注释。
根据研究随访期间BMI z分数和MetScore的纵向变化，将参与者分为高反应组（BMI-HR或MetScore-HR）和低反应组（BMI-LR或MetScore-LR）。如果参与者的减少幅度大于中位数变化，则被归类为高反应组。
统计分析包括使用Kolmogorov-Smirnov检验评估正态性，使用Kruskal-Wallis检验评估组间差异，使用Wilcoxon检验分析配对差异。Alpha多样性指数（香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson，表示为逆辛普森指数)、观测物种数(Observed species)、ACE和Fisher）在计算相对丰度后进行评估。使用线性回归模型评估Alpha多样性指数与干预反应之间的关联，并调整基线年龄、性别、干预组和BMI z分数变化。
使用线性判别分析效应量(LEfSe)在ASV水平识别高反应组和低反应组之间差异丰富的细菌类群。使用微生物组偏倚校正组成分析(ANCOM-BC2)在ASV水平估计偏倚校正后的对数倍数变化。为探索微生物群和临床特征的预测潜力，使用RStudio中的caret包训练随机森林(Random Forest)分类模型。特征选择首先使用包含所有属的随机森林模型进行，保留按平均精度减少度(Mean Decrease in Accuracy, MDA)排名前10%的肠道微生物群特征，用于训练最终分类模型。模型性能使用受试者工作特征曲线下面积(ROC AUC)评估。
使用Spearman等级相关识别不同Alpha多样性指数、基线细菌丰度与代谢健康参数之间的简单关联。进行受试者工作特征(ROC)分析以确定辛普森多样性指数的最佳截断值，该截断值用于将儿童分为干预前高多样性组或低多样性组。然后使用Kruskal-Wallis检验比较组间健康结果的改善情况。进行二元逻辑回归模型以量化基于多样性状况对干预产生不良反应的几率。
结果
研究参与者的特征
所有参与者的中位年龄为10.0岁，基线中位BMI z分数为2.60。基线时，高反应组和低反应组之间未观察到显著差异。干预结束时，被归类为BMI-LR的儿童显示出显著更高的BMI z分数、腰围z分数、甘油三酯浓度z分数和MetScore。同样，MetScore-LR组的参与者表现出显著更高的甘油三酯、收缩压和舒张压以及更高的MetScore。治疗后观察到显著变化，包括BMI z分数显著降低超过0.4 SD（p < 0.001），腰围降低-0.33 SD（p = 0.067），HOMA-IR降低-0.42 SD（p = 0.002）。观察到舒张压略有上升。最终与基线MetScore和BMI z分数值的中位数差异分别为-1.21和-0.37。
根据干预反应的肠道菌群特征
根据MetScore和BMI反应组总结的Alpha多样性指数显示，MetScore-HR组的Alpha多样性指数有更高的趋势，辛普森指数存在统计学显著差异。在BMI-HR组中，多样性指数通常高于BMI-LR组，但差异均未达到统计学显著性。
ANCOM-BC2识别出两个与BMI显著相关的分类单元：一个归属于胆固醇真杆菌组(Eubacterium coprostanoligenes group)的ASV和瘤胃球菌属(Ruminococcus)。总共有84个ASV与MetScore反应显著相关。其中几个ASV属于胆固醇真杆菌组、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)或瘤胃球菌属(Ruminococcus)。
LEfSe分析确定了与MetScore-HR和BMI-HR组相关的最具差异丰度的类群。在MetScore-HR组中富集的类群包括颤螺菌目(Oscillospirales)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)和红蝽菌目(Coriobacteriales)，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)，以及粪杆菌属(Faecalibacterium)、胆固醇真杆菌组(Eubacterium coprostanoligenes group)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)和UCG-003等属。在BMI-HR组中富集的类群包括粪杆菌属(Faecalibacterium)和罗斯氏菌属(Roseburia)。在MetScore-HR组中通过LEfSE识别出的不同属在ANCOM-BC2中显示出一致的对数倍数变化估计方向，包括属于瘤胃球菌属(Ruminococcus)和胆固醇真杆菌组(Eubacterium coprostanoligenes group)的ASV。
基线肠道菌群谱作为干预反应的预测因子
观察到基线辛普森指数和香农指数与干预后MetScore、收缩压和HDL-cholesterol的改善之间存在统计学显著关联。线性回归模型显示，调整临床协变量后，香农指数和辛普森指数解释了约30%的MetScore反应方差。与HDL-cholesterol改善的关联在调整后仍具有统计学显著性。
尽管有几个细菌类群与MetScore和BMI改善相关，但只有颤螺菌目(Oscillospirales)在经过错误发现率校正后仍与MetScore改善显著相关。
训练了一个随机森林分类器作为监督学习模型。特征选择使用变量重要性分数进行，保留了前10%的细菌属，将特征集从177个属减少到19个属。这些属与辛普森多样性指数和临床协变量一起被纳入随机森林模型，从而提高了模型性能和准确性。MetScore模型的ROC AUC达到0.876，BMI模型的ROC AUC达到0.873。两个模型的麦克尼马尔检验均无统计学显著性，表明分类错误分布平衡。
变量重要性分析基于基尼指数平均减少度，确定粪杆菌属(Faecalibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、副拟杆菌属(Parabacteroides)和罗斯氏菌属(Roseburia)是BMI改善的最主要贡献者，基线BMI和辛普森指数均位列前10位预测因子之内。
鉴于辛普森多样性在两个模型中的一致预测贡献，进行了ROC分析以确定能够区分低MetScore反应者的基线辛普森阈值。分析显示AUC为0.690，确定的最佳截断值为0.849。7名儿童被归类低于此阈值，并且与辛普森值较高的儿童相比，在MetScore方面的改善显著较低。同样的模式在收缩压和HDL-cholesterol中观察到，但与BMI z分数未发现关联。
二元逻辑回归模型评估了根据多样性阈值对治疗的反应。调整年龄、性别、BMI z分数变化和干预组后，被归类为低多样性组的参与者表现出对治疗不良反应的几率大约是高多样性组的9倍。在甘油三酯降低和收缩压降低方面也观察到相似趋势，表明了一致的模式。未观察到与BMI改善存在关联。
讨论
我们的研究结果表明，肥胖儿童的基线肠道菌群组成可能作为治疗有效性的有用预测因子。使用ANCOM-BC2，我们识别出几个在基线时反应组之间存在显著差异的细菌类群，特别是关于MetScore改善方面。使用LEfSe和随机森林的探索性分析揭示了一致的模式。两个模型都表明，MetScore的更大程度降低与颤螺菌目(Oscillospirales)、理研菌科(Rikenellaceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、胆固醇真杆菌组(Eubacterium coprostanoligenes group)以及粪杆菌属(Faecalibacterium)的较高基线丰度相关。此外，BMI z分数的更大程度改善与粪杆菌属(Faecalibacterium)和罗斯氏菌属(Roseburia)的较高丰度相关。较高的Alpha多样性也与心血管健康相关项目的显著更大程度改善相关。
先前的研究已经识别出可能调节成人减重干预反应的特定细菌类群。然而，不同肠道菌群组成在影响治疗结果中的具体作用仍然知之甚少。例如，Dao等人报告，嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的较高基线丰度与六周限制饮食干预后胰岛素敏感性和体脂分布的更大程度改善相关。在我们的样本中，理研菌科(Rikenellaceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的较高丰度与心脏代谢风险评分的更大程度改善相关。这些结果可能反映了有益的微生物功能，例如增加发酵和短链脂肪酸(SCFA)产生，已知对宿主代谢有积极影响。
为了进一步评估基线肠道菌群的预测能力，我们应用了监督机器学习模型。值得注意的是，粪杆菌属(Faecalibacterium)成为代谢和BMI反应的最强预测因子之一。该属是众所周知的丁酸盐生产者，具有已确立的抗炎特性。其最丰富的物种，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)，被认为是通过其对肠道屏障维持和免疫调节的贡献来调节肠道健康的关键，并且被认为是人类结肠中最重要的丁酸盐产生细菌之一。丁酸盐是结肠中非消化性碳水化合物发酵产生的最丰富的短链脂肪酸(SCFA)，作为结肠细胞的主要能源，支持肠道屏障完整性，并激活抗炎信号通路。最近一项儿科研究发现，将地中海饮食建议与丁酸盐补充剂相结合，与安慰剂相比，导致BMI更大程度的降低。值得注意的是，普拉梭菌(F. prausnitzii)的基线丰度与胰岛素敏感性改善相关，这与我们的观察结果一致，并支持该属在代谢健康中的核心作用。
早期肠道菌群组成可以预测生长轨迹和超重风险，并且越来越多的证据表明肠道菌群可以影响对饮食干预的反应，例如在炎症性肠综合征中。据我们所知，很少有研究探讨儿童肠道菌群与减重之间的关系。Nadal等人观察到，治疗后实现更大幅度减重的肥胖儿童具有较高的乳杆菌属(Lactobacillus)基线丰度。
我们还观察到胆固醇真杆菌组(Eubacterium coprostanoligenes group)与代谢健康改善相关。该组的成员可以将胆固醇转化为粪甾醇，这是一种难以吸收的代谢物。与此一致，几项研究报告了粪甾醇水平与血浆胆固醇之间的负相关，表明微生物胆固醇向粪甾醇的转化可能代表了人类胆固醇管理的潜在策略。
肠道菌群多样性，特别是通过辛普森多样性指数测量的，成为预测治疗成功的关键变量。我们确定了辛普森多样性指数的一个潜在截断值，如果在未来的研究中得到重复，可能有助于识别对干预反应较差风险较高的儿童。早期识别此类儿童可能使临床医生能够设计量身定制的干预措施，例如在开始生活方式改变之前通过益生元或丁酸盐补充剂增加肠道菌群多样性，从而最大限度地提高家庭努力的有效性。
如前所述，虽然肠道微生物组可以影响干预结果，但干预本身也可以改变肠道菌群。例如，接受热量限制饮食的儿童被证明可以增加Alpha多样性并富集有益菌株如粪杆菌属(Faecalibacterium)。因此，尽管我们识别出了与更好干预反应相关的特定类群，但单个类群的变异性和微生物群落内复杂的生态相互作用可能限制高精度预测个体结果的能力。
一个潜在的批评是，代谢健康的改善更可能归因于干预建议，而非基线肠道菌群组成。我们的分析是在坚持治疗方案的儿童子集上进行的，并且在调整体重减轻后结果仍然显著，这表明观察到的效应不能仅用体重减轻来解释，支持了肠道菌群在代谢改善中潜在的独立作用。
我们工作的一个局限性是每组样本量相对较小，这可能限制了我们研究结果的普适性。然而，值得强调的是，我们的结果与文献中先前的发现一致，并且这是儿童肠道菌群被分析并与干预后的健康结果纵向关联的最大样本量。努力控制了潜在的偏倚来源和混杂因素。
在将其应用于临床或公共卫生环境之前，必须在考虑不同年龄和国家的独立队列中验证微生物群多样性和组成的预测作用。这些发现的潜在进一步应用是开发个性化营养干预措施，旨在调节肠道菌群以提高治疗成功率。尽管在临床实践中评估肥胖儿童的微生物群多样性可能成本较高，但它可能有助于识别更可能从饮食干预中受益的个体。这种有针对性的方法可能有助于优化资源，并减少当干预未能产生结果时儿童及其家庭所经历的挫败感。
结论
总之，我们的研究强调了肠道菌群多样性以及特定细菌如粪杆菌属(Faecalibacterium)作为儿童在结构化生活方式干预后代谢健康和BMI改善的预测标志物的潜力。我们提出了一个微生物群多样性的阈值，可能有助于识别对此类干预反应可能性较低的个体。然而，需要在独立队列中对此阈值进行外部验证。进一步的研究应旨在全面整合生活方式因素、生理参数和微生物群特征，以改善肥胖儿童的个性化治疗策略。
