《International Journal of Nanomedicine》：Formulation and Application of a Human Insulin-Like Growth Factor 1-Loaded Transfersomal System to Enhance Skin Wound Healing in Diabetic Rat Models
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本研究开发了一种负载人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）的柔性脂质体（TF）经皮递送系统（TF/hIGF-1），用于治疗糖尿病皮肤伤口。通过薄膜水化法制备，其纳米颗粒呈球形，粒径小于100 nm，包封率达81.37%。体外研究证实，该纳米载体不仅能提高hIGF-1的稳定性，实现其可控释放（Korsmeyer-Peppas模型拟合最佳），还能显著促进NIH-3T3成纤维细胞的迁移与增殖。在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠模型中，与游离hIGF-1及其他对照组相比，包载于羧甲基纤维素（CMC）水凝胶中的TF/hIGF-1可显著加速伤口愈合，在12天内观察到近乎完全的伤口闭合。组织病理学分析进一步显示，治疗组表皮增厚，其皮再生增强，炎症细胞浸润减少。本研究为糖尿病伤口等皮肤疾病的治疗提供了一种具有前景的、高效的非侵入性局部给药新策略。
研究背景与目的
糖尿病患者的伤口愈合常因多种生长因子（如胰岛素样生长因子1，hIGF-1）表达水平降低而严重受损，导致慢性溃疡等并发症。hIGF-1作为一种关键的再生生长因子，能够刺激角质形成细胞和成纤维细胞的增殖、迁移与分化，并促进血管生成，是伤口愈合过程的核心调节因子。然而，hIGF-1作为多肽药物，在体内易被酶降解，半衰期短（小于15分钟），且口服和静脉注射给药分别存在生物利用度低和易引发低血糖等不良反应的风险。经皮给药作为一种局部、非侵入性的方式，具有持续释药、提高患者依从性等优势，但皮肤角质层是药物渗透的主要屏障。为克服这些障碍，本研究旨在开发一种基于柔性脂质体（TF）的纳米载体递送系统，用于负载hIGF-1（TF/hIGF-1），以期实现药物的可控、长效释放，从而有效促进糖尿病伤口的愈合。
材料与方法
纳米颗粒的制备与表征：采用薄膜水化法制备TF/hIGF-1纳米颗粒。具体以氢化大豆磷脂酰胆碱（Phospholipon 90 H）和脱氧胆酸钠（SDC）作为油相和边缘活化剂（EA），按4:1的重量比溶解于氯仿中，经旋转蒸发形成干燥脂质膜。随后，使用含hIGF-1的磷酸盐缓冲液（PBS）在37°C下水化薄膜，再经探针超声和挤出过滤，得到所需尺寸的纳米粒。通过动态光散射（DLS）测定其水合粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位，并使用透射电子显微镜（TEM）观察其形态。采用Bradford蛋白测定法计算包封率（EE%）和载药量（DL%）。
体外释放与稳定性研究：通过透析法评估hIGF-1从TF中的体外释放动力学，并利用SDS-PAGE结合银染技术分析释放后hIGF-1在48小时内的短期稳定性。
水凝胶的合成：为便于局部应用，将TF/hIGF-1纳米粒负载到羧甲基纤维素（CMC）水凝胶中，制备成TF/hIGF-1-CMC水凝胶敷料。
体外细胞实验：使用NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞系进行实验。通过MTS法评估不同浓度游离hIGF-1、空白TF及TF/hIGF-1处理24、48、72小时后对细胞活力的影响。通过细胞划痕实验，定量分析不同处理组（包括游离hIGF-1、TF/hIGF-1、空白TF及未处理对照）在144小时内对细胞迁移和“伤口”闭合的促进作用。
体内动物实验：使用成年雄性Wistar大鼠，通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病模型（血糖>250 mg/dL视为造模成功）。在每只大鼠背部制造三个直径8 mm的全层皮肤伤口。动物被分为正常组和糖尿病组，每组下再设多个亚组，包括：未处理组、仅用水凝胶组、空白TF水凝胶组、游离hIGF-1水凝胶组以及TF/hIGF-1水凝胶组。每4天敷药一次，持续观察12天，定期拍照记录伤口面积变化。在首个伤口愈合时（第12天）处死动物，取伤口及周围皮肤组织进行苏木精-伊红（H&E）染色，从组织病理学角度评估表皮厚度、炎症细胞浸润、纤维化及组织结构再生等情况。
结果
纳米颗粒的理化特性：优化后的TF/hIGF-1纳米颗粒呈分散的球形，TEM图像显示其粒径在100 nm以下。DLS测定其平均粒径为57.56 ± 3 nm，PDI为0.194，Zeta电位为-50.1 mV。包封率和载药量分别为81.37%和0.4%，表明制备工艺成功。
体外释放与稳定性：SDS-PAGE分析证实，从TF中释放的hIGF-1在48小时内保持结构完整，主要以约8 kDa的单体形式存在，未见明显降解。释放动力学研究表明，TF/hIGF-1实现了hIGF-1的缓释可控，前10小时释放约50%，48小时内累计释放约80%，其释放曲线最佳符合Korsmeyer-Peppas模型。
体外细胞效应：MTS实验显示，在24小时，TF/hIGF-1和游离hIGF-1均能显著促进NIH-3T3细胞的增殖；至72小时，TF/hIGF-1组显示出比游离hIGF-1更持续的促增殖效果，表明纳米包封延长了hIGF-1的生物活性。划痕实验结果表明，与对照组相比，添加25 ng/mL游离hIGF-1或12.5 ng/mL TF/hIGF-1能显著加速细胞迁移。在144小时，12.5 ng/mL TF/hIGF-1处理组的细胞单层划痕实现了完全闭合。
体内伤口愈合效果：在糖尿病大鼠模型中，与未处理组、空白水凝胶组及空白TF水凝胶组相比，TF/hIGF-1水凝胶治疗组的伤口愈合速度显著加快。至第12天，其伤口面积显著缩小，接近完全愈合。统计分析进一步量化了各组间的差异。
组织病理学分析：H&E染色切片显示，与对照组（表现为严重水肿、组织结构紊乱、炎症细胞大量浸润）相比，hIGF-1水凝胶和TF/hIGF-1水凝胶治疗组的伤口组织状态更为有序。特别是在TF/hIGF-1治疗组中，观察到表皮明显增厚，其皮层有更多的梭形成纤维细胞和新生肉芽组织，纤维化增加，而炎症细胞和扩张的血管减少，这些均是伤口从炎症期向愈合期过渡的良好迹象。在非糖尿病大鼠中也观察到了类似的治疗趋势，但糖尿病组的基线损伤更严重，治疗后的改善对比更明显。
讨论
本研究成功构建了TF/hIGF-1纳米递送系统。TF凭借其高变形性，有助于负载的药物穿透皮肤屏障。研究所用的磷脂和边缘活化剂配方，使得纳米颗粒具有适宜的粒径、均匀的分布（低PDI）以及较高的负Zeta电位，后者有利于体系的物理稳定性。高达81.37%的包封率确保了大部分药物被有效负载。体外释放和稳定性数据共同证实，该系统不仅能保护hIGF-1免于快速降解，还能实现其长效、可控的释放，这与Korsmeyer-Peppas模型揭示的以扩散和骨架溶蚀为主的释放机制相符。
细胞实验结果表明，TF/hIGF-1不仅能有效促进成纤维细胞增殖，其效果在长时程培养中优于游离药物，暗示纳米包封可能通过延缓生长因子的降解或持续激活细胞表面的胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）及其下游促有丝分裂信号通路（如PI3K/Akt, MAPK/Erk通路），从而发挥更持久的生物学效应。划痕实验的完美闭合进一步直观证明了其在模拟伤口愈合过程中的强大促迁移能力。
动物实验是本研究的关键验证。在复杂的糖尿病病理环境中，TF/hIGF-1-CMC水凝胶展现了卓越的治疗效果。其促愈合作用可能源于多方面的协同：首先，TF纳米粒作为“特洛伊木马”，帮助hIGF-1更深入地渗透至伤口床；其次，缓释特性使伤口局部能长时间维持有效的药物浓度，持续刺激细胞增殖、迁移、胶原合成和血管生成；最后，CMC水凝胶本身提供了一个湿润的愈合环境，并能将药物固定在创面。组织病理学结果为此提供了微观证据：治疗组表皮增厚、其皮结构重建、炎症消退，这些都是高质量伤口愈合的标志。
结论
综上所述，本研究成功制备并表征了负载hIGF-1的柔性脂质体纳米颗粒（TF/hIGF-1）。该递送系统显著提高了hIGF-1的稳定性，实现了其在体外的可控释放，并有效促进了成纤维细胞的迁移与增殖。在STZ诱导的糖尿病大鼠模型中，负载于CMC水凝胶中的TF/hIGF-1展现了优异的促伤口愈合能力，能在12天内显著加速伤口闭合，并通过组织学证实了其增强表皮再生与其皮修复的效果。这些发现为治疗糖尿病慢性伤口及其他难愈性皮肤损伤（如纤维化、炎症性皮肤病）提供了一种具有广阔应用前景的新型局部给药策略。未来的研究可深入探索TF/hIGF-1在分子水平上加速糖尿病伤口修复的具体作用机制，以进一步优化其疗效与安全性。
