《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Reactive oxygen species (ROS) research in drug discovery and drug delivery: Can the medium Be a Trojan Horse disguised as something benign?
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本研究提出重要警示：在H2O2诱导的细胞氧化应激模型中，多种常用培养基（如Fluorobrite DMEM）本身可化学催化生成高活性氧（hROS），严重干扰数据解读。作者通过比较多种培养基，推荐Medium 199作为背景干扰最小的选择，为氧化还原机制研究与ROS敏感性药物递送提供了更严谨的实验模型基础。
导论
活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）是包括过氧化氢（H2O2）、次氯酸根（OCl–）、超氧阴离子（O2•–）、羟基自由基（OH•）、过氧亚硝酸盐（ONOO–）和单线态氧（1O2）等在内的一系列化学物质的统称。它们在多种疾病如癌症、病毒感染、心血管疾病、神经退行性疾病、慢性炎症和糖尿病中扮演着重要角色。因此，ROS研究对于理解其病理生理学功能和信号传导，以及开发针对氧化应激条件下组织/细胞的ROS敏感性药物递送和成像系统至关重要。在ROS研究中，需要建立合适的细胞氧化应激模型。常用的诱导方法包括使用甲萘醌、溴酸钾和过氧化氢（H2O2），其中添加外源性H2O2是最常用的方法。这类研究通常通过检测高活性氧（highly reactive oxygen species， hROS）的生成作为细胞氧化应激的指标。hROS没有严格定义，但传统上认为任何比H2O2更具反应性的ROS都属于hROS，如羟基自由基和次氯酸根等。从动力学角度看，这些物种的反应活性差异巨大。然而，此类模型的有效性基于一个关键假设：hROS的形成是细胞生化过程的结果，而非培养基所致。本文揭示了许多常用培养基在添加H2O2后，即使没有细胞，也会产生显著的hROS，这对模型的效度提出了质疑，并暗示培养基可能在数据中扮演了“特洛伊木马”的角色，干扰研究结果。
hROS检测方法
在研究hROS时，常用的方法是使用荧光化学探针，其中最常用的是商业化的DCFH（2，7-二氯二氢荧光素）及其二乙酸酯（DCFH-DA）用于细胞内研究。DCFH-DA的优势是能够细胞渗透，并可在细胞内通过简单的二酯水解而被捕获。然而，DCFH-DA中对H2O2惰性，且对hROS具有选择性，是其检测的基础。
培养基：ROS研究中被伪装的特洛伊木马
使用H2O2诱导细胞氧化应激并使用DCFH-DA检测
为了开发ROS敏感的药物递送方法，首先需要评估在不同条件下诱导细胞氧化应激后的hROS生成。研究选择了最常用的方法，即使用高浓度外源性H2O2在三种细胞系（4T1、HeLa和HEK293T）中诱导氧化应激。初步实验使用了最常用的Fluorobrite DMEM培养基。与未添加H2O2的对照组相比，所有三种细胞系在添加200 μM H2O2后均显示出显著更高的荧光信号。这些结果似乎与文献报道的H2O2诱导氧化应激导致hROS生成一致。
细胞培养基自身也能诱导显著的hROS生成
除了常规对照组，研究还进行了额外的对照实验：在没有细胞的培养基（Fluorobrite DMEM）中孵育DCFH-DA和H2O2。结果发现，即使在没有细胞的情况下，也观察到了显著的探针荧光开启效应。这表明培养基本身在无细胞条件下也能产生显著水平的hROS。由于已知DCFH-DA不与H2O2本身反应，因此必然是培养基中存在某些因子激活了H2O2。由于Fluorobrite是专有配方，成分未公开，研究者推测其可能含有与DMEM类似的成分。值得注意的是，DMEM中含有硝酸铁（Fe(NO3)3）。铁离子已知可与H2O2反应产生羟基自由基等hROS，这是著名的芬顿（Fenton）反应。尽管游离Fe3+与H2O2的反应较慢，但当Fe3+被螯合时，反应速率会大大加快。培养基中可能存在多种成分螯合铁离子，从而促进H2O2的活化。这些结果表明，培养基成分可能显著干扰此类ROS研究。
筛选其他细胞培养基以寻找hROS产生最少的培养液
鉴于活性培养基配方对hROS产生的深远影响，研究者进一步筛选了其他常用细胞培养基，以了解可能的干扰因素并寻找hROS产生最少的培养基成分。研究比较了DCFH-DA和DCFH在不同培养基中添加H2O2后的氧化情况。实验首先在pH 7.4的PBS缓冲液中进行了对照实验，发现没有显著的荧光增加，这与DCFH-DA不与H2O2反应的已知特性一致。随后，在多种培养基（37°C）中孵育DCFH-DA（10 μM）与不同浓度的H2O2（50， 100和200 μM）。在所有测试的培养基配方中，Fluorobrite DMEM、MEM、DMEM和RPMI-1640中观察到了浓度依赖性的荧光开启，而Medium 199和添加了丙酮酸钠的DMEM则显示出不显著的探针荧光开启。丙酮酸钠的差异是可以理解的，因为已知丙酮酸钠能与H2O2反应。具体来说，丙酮酸钠与H2O2反应的二级速率常数为2.4 M?1s?1，这使得它能够在探针反应之前消耗H2O2和/或其活化形式。为了验证这一点，研究者在Fluorobrite DMEM、RPMI 1640和MEM中添加了丙酮酸钠（最终浓度为1 mM），发现这三种配方中均未出现荧光开启。这些结果表明丙酮酸钠消耗了H2O2和/或hROS。
之前分析认为DMEM中的硝酸铁可能是无细胞条件下hROS产生的因素之一。然而，Medium 199中的硝酸铁浓度（1.73 μM）高于DMEM，但却没有激活H2O2与DCFH-DA反应。虽然具体原因尚不清楚，但这并不令人意外，因为Fe(III)激活H2O2的能力高度依赖于螯合作用。两种培养基成分的一个显著差异是肌醇浓度，DMEM中为40 μM，而Medium 199中为0.28 μM。然而，将肌醇添加到Medium 199中并未改变结果。Fe(III)激活H2O2的能力受许多因素影响。重要的是，Medium 199似乎是干扰最小的培养基。为了评估H2O2在Medium 199中是否真正稳定（即hROS是否生成但被其他成分消耗），研究者使用了一种基于硼酸盐的探针 1 来检测Medium 199中的H2O2。在Medium 199和PBS中，探针 1 与H2O2的反应均达到相似的荧光强度平台，表明H2O2在Medium 199中是稳定的。此外，测定的二级速率常数在Medium 199和PBS中处于相似范围（PBS中为2.6 ± 0.11 M?1s?1， Medium 199中为4.3 ± 0.21 M?1s?1）。这些结果表明Medium 199的反应性最低，适合用于H2O2诱导氧化应激的细胞培养研究。
值得注意的是，RPMI 1640和MEM不含Fe(III)，但它们仍然能激活H2O2与DCFH-DA反应。这意味着H2O2的活化涉及不止一个因素。鉴于ROS的异质性，可能有多重因素导致观察到的结果。例如，看似良性的溶剂如乙腈可以加速H2O2的反应。同样，培养基配方也可能含有多种成分，加速H2O2的反应。
即使在反应性最低的培养基配方中，培养基诱导的hROS形成仍然显著
在Medium 199作为H2O2实验中看似最“良性”的培养基后，研究者有兴趣在Medium 199中研究所有三种细胞（4T1， HeLa和HEK293T）的氧化应激诱导。使用了与DMEM培养基相似的方案和条件。在这三种细胞中，当使用10 μM DCFH-DA和200 μM H2O2时，HEK293T细胞显示出与未添加H2O2的对照组相比，hROS产生显著增加（4倍）。这种增加显著高于培养基本身，表明hROS的形成可归因于细胞活动。另一方面，在相同条件下，4T1和HeLa细胞显示出轻微到边缘的荧光增加（1倍）。4T1和HeLa的这种微小增加与Medium 199本身的情况相似。对此观察结果可能存在多种解释。总体而言，Medium 199最有可能没有通过化学活化H2O2而产生实质性的背景干扰问题。
结论
研究细胞氧化应激显然是一项具有挑战性的任务。hROS本身的极高反应性给此类研究带来了固有的困难。此外，直接在动物模型中研究氧化应激面临着更大的挑战。因此，细胞模型对于详细的机制研究至关重要，这些研究构成了制定适当药物发现和递送策略的基础。然而，目前尚不清楚什么才是一个好的细胞模型，尽管有一些常用的方法。无论使用何种方法，最基本的要求是细胞模型必须真正模拟内源性氧化应激。这一要求决定了需要使用那些由非细胞事件机制引起的氧化反应最小的模型。在此背景下，研究者研究了在添加H2O2创建的氧化模型中培养基的影响。为此，检测了以下细胞培养基：Fluorobright DMEM， DMEM， RPMI 1640， MEM和Medium 199。研究发现，Fluorobright DMEM， DMEM， RPMI 1640和MEM会引起显著水平的hROS产生，这可能引发对在此类培养基中添加H2O2来模拟内源性氧化应激的有效性的质疑。尽管添加了丙酮酸盐的DMEM显示出最低水平的hROS产生，但它也消耗H2O2，可能导致向细胞添加H2O2的努力付诸东流。类似地，培养基中产生的hROS也可能与其他成分反应。另一方面，Medium 199显示出化学诱导的hROS产生水平最低，似乎是用于细胞氧化应激研究的良好候选培养基。尽管Medium 199和DMEM都含有硝酸铁，但它们在激活H2O2方面具有非常不同的活性。造成差异的原因可能是Fe(III)在适当螯合下对H2O2的催化活化，也可能存在其他未知因素。此外，丙酮酸盐被证明可以促进hROS降解。本文描述的观察结果，连同溶剂（如DMSO）和缓冲液（如HEPES， MES， 乙酸铵和Tris）对ROS研究的影响，表明在机制研究中处理hROS时需要严格对照和格外谨慎。否则，溶剂、培养基和缓冲液成分的影响都可能成为损害实验数据和数据解读的“特洛伊木马”。鉴于细胞培养模型在ROS相关药物发现和递送研究中的关键性质，希望本研究的结果将有助于提高ROS研究的严谨性并加强其基础。
