《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Discovery of novel coumarin-containing triazolo[1,5-a]pyrimidine derivatives as potent ABCB1 inhibitor for modulation of multidrug resistance
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本研究揭示了一类新型硫醇取代氨基香豆素-香豆素-三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物(5a-5s)，其中化合物5r (NYH-707)被鉴定为强效的ABCB1 (P-糖蛋白)抑制剂。NYH-707在体外显著恢复SW620/Ad300多药耐药细胞对紫杉醇(PTX)的敏感性，逆转倍数高达413.6，并通过分子对接预测与靶点有强相互作用。CETSA及药物蓄积实验证实了NYH-707与ABCB1的直接结合及对转运功能的抑制。体内实验表明，NYH-707与紫杉醇联用可显著抑制SW620/Ad300移植瘤生长，且未观察到系统性毒性。该研究为克服肿瘤多药耐药(MDR)提供了一种具有高活性和良好安全性的新型候选化合物。
引言
多药耐药(MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因之一，而由ATP结合盒转运蛋白ABCB1（亦称P-糖蛋白）介导的药物外排是其中关键机制。尽管针对ABCB1的抑制剂如维拉帕米和他喹达已被开发，但其临床转化常因毒性或药物相互作用等问题受阻。因此，开发新型高效、低毒的ABCB1抑制剂是逆转MDR的重要策略。本研究基于表型筛选，设计并合成了一系列硫醇取代的氨基香豆素衍生的含香豆素三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物(5a-5s)，旨在发现下一代ABCB1调节剂。
细胞筛选鉴定出新的ABCB1抑制剂
研究团队以具有初步活性的化合物5a为基础，在硫醇取代位点进行结构多样化，构建了化合物库(5a-5s)。在稳定过表达ABCB1的人结肠癌多药耐药细胞系SW620/Ad300中，研究人员评估了这些化合物对经典ABCB1底物紫杉醇(PTX)细胞毒性的逆转作用。结果表明，单独使用时，紫杉醇对SW620/Ad300细胞的半数抑制浓度(IC50)为4.55 ± 0.73 μM。在非细胞毒浓度下，多个化合物显著增强了紫杉醇的敏感性。其中，化合物5j、5k的逆转效果(RF)已超过阳性对照药维拉帕米(VPM, RF=12.64)。而化合物5r (NYH-707)表现最为突出，能将紫杉醇的IC50降至0.011 ± 0.002 μM，逆转倍数高达413.63，远超过其他衍生物。结构-活性关系(SAR)分析显示，适度的吸电子取代基（如卤素、硝基）通常产生较强的逆转效果，而大体积或刚性取代基则活性较弱。
分子对接与构效关系分析
分子对接实验揭示了NYH-707卓越活性的结构基础。NYH-707与人类ABCB1蛋白(PDB: 7A69)显示出最低的结合能(-9.7 kcal/mol)。其结合模式涉及与关键氨基酸残基LYS-826、SER-880和SER-238形成的氢键网络，以及与PHE-994的强π-π堆积作用。此外，NYH-707还与ALA-995、PRO-996、ALA-823、LEU-236、MET-876和LYS-877等残基存在广泛的π-烷基、疏水和范德华相互作用。这种多点结合模式使其能够深埋于ABCB1的疏水腔内，实现完全的口袋占据，从而解释了其超高的结合亲和力与抑制活性。
ABCB1稳定性与定位分析
为了从功能上验证NYH-707与ABCB1的直接相互作用，研究人员进行了细胞热位移分析(CETSA)和免疫荧光实验。CETSA结果显示，NYH-707能够显著提高ABCB1的热稳定性，表明其能与ABCB1直接结合并保护蛋白质免于热诱导变性。免疫荧光分析则显示，NYH-707处理并未改变ABCB1在细胞膜上的定位，也未导致其内化或降解。这些结果共同表明，NYH-707通过直接结合ABCB1，稳定了其蛋白构象并维持了其在细胞膜上的功能性存在，这很可能抑制了其药物外排功能，从而有效逆转了多药耐药。
体内外毒理学评估
在体内安全性评价中，BALB/c小鼠单次口服200 mg/kg剂量的NYH-707，观察14天后，未发生死亡，小鼠体重、血清白蛋白(ALB)、血尿素氮(BUN)等指标与对照组相比均无显著差异。主要器官的组织病理学检查也未见明显损伤，表明NYH-707具有初步的良好的安全性。
体内移植瘤药效学验证
为进一步评估NYH-707的体内疗效，研究团队在建立了SW620/Ad300移植瘤的裸鼠模型中，测试了NYH-707与紫杉醇联合治疗的抗肿瘤效果。结果显示，与单用紫杉醇或紫杉醇联合维拉帕米相比，NYH-707联合紫杉醇能更显著地抑制肿瘤生长，并显著降低最终肿瘤重量。在整个治疗期间，各治疗组小鼠的体重保持稳定，主要器官的组织学和血清生化参数也未见异常，表明该联合治疗方案具有良好的体内耐受性，并未引起可检测的系统性毒性。
讨论与结论
本研究通过系统性的结构设计，发现了一个以NYH-707为代表的新型、强效的ABCB1抑制剂家族。其作用机制可能涉及与ABCB1的直接结合，并可能通过稳定其特定的非生产性构象，干扰其从ATP水解到药物外排的能量偶联过程，从而抑制转运功能。体外和体内实验均证实，NYH-707能够高效逆转由ABCB1过表达介导的结肠癌多药耐药，并展现出了良好的安全性。综上，NYH-707结合了高活性、高选择性和低毒性的优势，是一种极具潜力的下一代ABCB1抑制剂候选药物，为克服临床肿瘤多药耐药问题提供了新的思路和先导化合物。未来的研究将进一步评估其对其他ABCB1底物药物的增效作用，并进行全面的药代动力学、药效学和长期安全性评价。
