【药代动力学-药效学模型评估免疫应答与美罗培南在体内杀菌中的相对影响】

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling to evaluate the relative impact of immune response and meropenem on bacterial killing in vivo

本文运用药代动力学-药效学（PKPD）模型，量化了美罗培南在小鼠肺部感染模型中杀菌作用与宿主免疫应答的相对贡献，揭示了免疫状态对药物PKPD特性及剂量反应的关键影响，为抗生素在免疫状态各异患者中的精准用药提供了新见解。

　　

ABSTRACT

本研究的目的是通过药代动力学-药效学（PKPD）模型，在小鼠肺部感染模型中评估免疫状态对美罗培南PKPD和剂量反应的影响，并量化免疫应答与美罗培南对细菌杀伤的相对贡献。研究分析了在不同免疫抑制水平（中性粒细胞减少、中度抑制或免疫健全）小鼠中，每隔4小时给予40或300 mg/kg美罗培南后血浆和肺上皮衬液中药代动力学（PK）及24小时内细菌计数的变化。开发的PKPD模型能够量化随时间推移免疫应答和美罗培南对细菌的杀伤作用。研究还通过模拟剂量分级研究，探讨了不同免疫状态下美罗培南的剂量反应。观察到的美罗培南浓度-时间曲线差异可以通过免疫健全小鼠分布容积更大来解释。免疫应答通过吞噬和消化过程来描述。美罗培南效应最佳量化是基于血浆浓度，其最大杀灭速率为0.934 h^-1，EC₅₀= 1.62 mg/L。美罗培南在中度抑制和免疫健全条件下对细菌杀伤贡献较低，这被解释为受美罗培南影响的细菌比例较低。模拟表明，免疫状态影响了PKPD靶标的推导。

INTRODUCTION

尽管免疫应答在感染控制中至关重要，但其对细菌杀伤的定量贡献，尤其是在抗生素存在的情况下，仍未完全阐明。抗生素（如碳青霉烯类的美罗培南）在临床实践中对于治疗细菌感染至关重要。在抗生素药物开发和监管评估期间，动物感染模型是PKPD表征的关键，其中中性粒细胞减少小鼠大腿和肺部感染模型最为常见。PKPD建模已越来越多地用于描述抗生素效应的时间过程。然而，很少有研究量化免疫抑制对细菌杀伤的影响，而同时考虑药物效应和免疫应答的模型尤为稀缺。美罗培南的PKPD已在体外和中性粒细胞减少体内条件下进行了广泛研究，但关于美罗培南PKPD如何依赖于免疫健全条件知之甚少。本研究旨在通过PKPD建模量化美罗培南和免疫系统在小鼠肺部感染模型中对细菌杀伤的相对贡献，从而表征美罗培南在中性粒细胞减少和免疫健全条件下的PK和PKPD，并通过模拟探索免疫系统对美罗培南剂量反应和衍生PKPD靶标的影响。

MATERIALS AND METHODS

Mouse lung infection model

使用6-10周龄的CD-1雌性小鼠，采用标准化小鼠肺部感染模型（COMBINE肺炎模型），并在免疫状态方面对标准模型进行了修改。通过两种不同的环磷酰胺腹腔给药方案诱导小鼠不同程度的免疫抑制：中度抑制状态在感染前4天和1天分别给予75和50 mg/kg腹腔注射，而中性粒细胞减少状态在同一时间点分别给予200和150 mg/kg。对于免疫健全状态，则不给予环磷酰胺。

Sampling and analyses

在PK实验中，收集血浆样本并使用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定总美罗培南浓度。在PD实验中，通过临床血液分析仪测定全血细胞计数。对于菌落形成单位（CFU）计数，收集右肺并在含有Triton X-100的PBS中匀浆，将系列稀释液涂布在胰蛋白酶大豆琼脂上，在37°C培养过夜。

PK modeling

研究了房室模型来描述美罗培南血浆和肺（上皮衬液，ELF）浓度。评估了皮下给药后的一级或零级吸收过程。评估了免疫健全和中性粒细胞减少小鼠之间PK参数的潜在差异。

PKPD modeling

PKPD模型结构的开发分为两步。首先，单独分析对照组数据，开发细菌生长和免疫应答的模型结构。其次，纳入治疗组数据，同时分析所有数据以表征美罗培南效应。细菌被描述为处于生长且药物敏感的（S）状态，或处于休眠（或静止）、不生长且非药物敏感的（D）状态。细菌生长由速率常数k_growth定义。在这两种状态下，均实施了非免疫相关的自然死亡率常数k_death。从S到D的转移速率常数k_SD与当前细菌总数和系统最大容量B_max相关联，公式为k_SD= (S + D)?(k_growth? k_death)/B_max。免疫应答被描述为吞噬和消化过程。处于S和D状态的细菌以速率k_phag转移到第三个细菌状态，即吞噬（P）状态，随后以速率k_dig被消化并从系统中清除。P状态的细菌也被认为对总CFU计数有贡献，但不计入B_max，因为在计数程序前吞噬细胞已被裂解。评估了k_phag和k_dig速率是否依赖于免疫状态。研究了粒细胞募集到感染部位的情况。由于先前研究表明粒细胞杀伤率在高细菌负荷下会受到饱和影响，因此探索了描述随着P细菌相对于可用粒细胞数量增加而吞噬活性降低的函数。美罗培南效应被实施为对S状态细菌的额外杀灭率k_drug。细菌动力学由相关方程描述（详见正文方程1-3）。使用PK模型预测的未结合美罗培南血浆（fu = 0.81）或ELF浓度来驱动药物效应。使用斜率或幂函数模型（γ = 1或γ ≠ 1）及E_max或sigmoid E_max模型评估美罗培南效应（详见正文方程4-5）。

Simulation of dose-ranging and dose-fractionation studies

使用最终PKPD模型预测在中性粒细胞减少、中度抑制和免疫健全条件下小鼠肺部感染模型中，美罗培南研究的反应。所有模拟均考虑接种量为7.5 log₁₀CFU/肺，且不考虑残差变异性。模拟了剂量范围研究（每4小时给药20至1,200 mg/kg）和剂量分级研究（总剂量相当于每4小时40和300 mg/kg方案，分为每2、4、6或8小时给药），以探索24小时治疗期间的预测细菌动态。模拟了26小时（开始治疗后24小时）的细菌计数，并与衍生出的PK/PD指数相关联：未结合药物最大浓度与最低抑菌浓度的比值（fC_max/MIC）、未结合浓度-时间曲线下面积与MIC的比值（fAUC/MIC）、以及未结合浓度超过MIC的时间分数（fT_>MIC）。使用sigmoid E_max函数评估26小时细菌计数与PK/PD指数之间的关系（详见正文方程6）。

Data analysis and software

模型开发使用NONMEM 7.5.0进行，辅以Perl-speaks-NONMEM版本5.2.6，使用带交互的拉普拉斯条件估计算法。PK建模采用对数变换-双边方法，并使用M3方法处理低于定量下限的数据。PKPD建模采用log₁₀变换-双边方法。残差误差通过对数变换尺度上的加性项描述。使用目标函数值差异评估参数纳入。模型选择标准还包括科学合理性、使用抽样重要性重采样估计的参数不确定性以及包括基于模拟的视觉预测检查在内的拟合优度图。数据管理和图形分析使用R version 4.3.3进行。模拟在NONMEM 7.5.0和使用mrgsolve version 1.5.1的R中进行。PK/PD指数的曲线拟合使用R中的drc version 3.0-1包进行。

RESULTS

Mouse PK experiments and PK modeling

皮下给药后美罗培南血浆PK由一室模型捕获，具有一级吸收，而ELF中的肺浓度由二室模型描述。模型未保留血浆和肺室之间的质量转移，以提高稳定性和提供可靠的血浆预测。在嗜中性粒细胞减少和免疫健全小鼠之间观察到血浆和ELF浓度-时间曲线的差异，最好的描述是不同的中央室分布容积，嗜中性粒细胞减少和免疫健全小鼠的中央室容积分别为2.19和3.40 L/kg。在PKPD建模中，根据PD实验中血细胞计数的中位数，通过线性插值将中度抑制小鼠的美罗培南中央室分布容积缩放至2.46 L/kg。参数估计的精度可接受（相对标准误差< 40%）。视觉预测检查表明，对于两个剂量组和两种免疫状态，模型都能很好地描述血浆和ELF浓度。

Mouse PD experiments and PKPD modeling

感染后2小时观察到的中位数细菌计数在嗜中性粒细胞减少组、中度抑制组和健全组中分别为7.56、7.80和7.52 log₁₀CFU/肺。白细胞和血液粒细胞计数没有观察到明显的时间趋势。因此，未探索粒细胞血液动力学建模，但研究了中位数粒细胞计数以缩放k_phag和/或k_dig。与使用免疫状态作为分类协变量相比，这导致了更差的模型拟合。最终模型的结构如图2所示。a, absorption rate constant. k_death, bacterial natural death rate constant. k_dig, digestion rate constant. k_drug, meropenem effect rate constant. k_e, elimination rate constant. k_growth, bacterial growth rate constant. k_phag, phagocytosis rate constant. k_SD, transfer from susceptible to dormant state rate constant. L_ELF, meropenem ELF compartment. L₂, meropenem second lung compartment. P, phagocytosed bacteria. S, susceptible bacteria. Q and Q₂, intercompartmental clearances.">由于对照组未出现细菌平台期，B_max无法可靠估计，因此固定为感染后26小时嗜中性粒细胞减少对照组细菌计数的中位数。数据不支持免疫应答的饱和或描述粒细胞募集到感染部位的函数。免疫应答使用针对每种免疫状态的参数进行探索。嗜中性粒细胞减少条件下的吞噬速率IR_neu与k_growth无法区分，因此固定为0，而k_growth估计为0.372 h^-1。中度和免疫健全条件下的吞噬速率分别估计为0.185和0.318 h^-1。消化速率k_dig与k_phag无显著差异。

免疫健全条件下的对照组和治疗组细菌计数总体较低（图3）。10 CFU/lung) between median bacterial counts in treatment groups and median bacterial counts in control groups for the corresponding times and immune states.">然而，美罗培南对细菌杀伤的贡献取决于免疫状态，在中度抑制和健全组中，美罗培南相关的细菌杀伤减少。例如，在每4小时300 mg/kg组中，26小时时CFU相比对照组的减少中位数在嗜中性粒细胞减少小鼠中约为4 log₁₀CFU，而在免疫健全小鼠中约为2 log₁₀CFU。当血浆浓度-时间曲线（而非ELF浓度-时间曲线）驱动美罗培南引起的细菌杀灭时，模型拟合更好。幂函数和E_max模型表现出相似的性能。最终模型能够捕获不同剂量组和免疫状态下观察到的细菌计数。

Simulated dose-ranging and dose-fractionation studies

正如原始数据所示，与嗜中性粒细胞减少小鼠相比，在其他免疫状态下预测的24小时细菌计数剂量间相对差异较小，表明免疫健全条件下剂量-反应梯度减小。同样，在剂量分级研究中，尽管在所有免疫状态下频繁给药导致最低的细菌计数，但嗜中性粒细胞减少小鼠中q2h给药与其他给药间隔之间预测的细菌杀灭差异更大。预测在嗜中性粒细胞减少小鼠中仅能实现生长或停滞的最低剂量或最长给药间隔（例如20 mg/kg q4h和80 mg/kg q8h），在中度和免疫健全小鼠中在24小时可实现净杀灭。对于最高剂量或最频繁的给药（例如1,200 mg/kg q4h和150 mg/kg q2h），预测嗜中性粒细胞减少小鼠的24小时细菌计数低于中度抑制小鼠。

对于所有免疫状态，PK/PD指数（图6）显示fT_>MIC与治疗24小时后预测的细菌计数相关性最高（R²> 0.9）。然而，fAUC/MIC的R²值在免疫健全条件下明显提高（免疫健全和中性粒细胞减少状态下分别为0.74和0.31）。在中度和免疫健全条件下，达到近最大效应所需的fT_>MIC值低于嗜中性粒细胞减少条件。然而，在高fT_>MIC值时，与对照组相比，细菌计数的log₁₀减少在免疫健全条件下低于嗜中性粒细胞减少条件。

DISCUSSION

本研究使用标准化小鼠肺部感染模型，通过不同程度的免疫抑制，通过PKPD模型量化了免疫应答对细菌杀伤的贡献及其对美罗培南PKPD随时间的影响。观察到的美罗培南血浆和ELF浓度表明，PK谱因免疫状态而异。免疫健全小鼠血浆分布容积减少可能是由于环磷酰胺影响一般健康状况和体液平衡，或由于进入免疫细胞的美罗培南减少。这些发现强调了在用于PKPD分析的实验条件下评估抗生素PK的重要性。所开发的PKPD模型将免疫应答描述为嗜中性粒细胞减少小鼠中估计的细菌表观生长（考虑免疫应答），以及中度和健全小鼠中分别为0.185和0.318 h^-1的吞噬速率。无法描述粒细胞动力学，因为血细胞计数在24小时内没有增加，这与环磷酰胺治疗后中性粒细胞恢复需要多天的时间一致。此外，PKPD模型中无法表征与中性粒细胞募集到感染部位相关的免疫应答延迟和变化，因为吞噬和消化过程之间的时间延迟足以描述观察到的数据。在嗜中性粒细胞减少条件下，免疫系统的影响与细菌生长速率无法区分。需要额外数据（例如不同接种量的实验）来区分嗜中性粒细胞减少条件下的细菌生长和免疫应答。

美罗培南对细菌杀伤的贡献取决于免疫状态，比较治疗组和对照组时，嗜中性粒细胞减少条件下的细菌杀伤高于其他免疫状态。然而，免疫状态之间美罗培南效应参数没有显著差异。观察到的差异最好解释为在免疫健全条件下，更高比例的细菌转移到P室，从而在S室中暴露于美罗培南的细菌比例较低。因此，虽然内化的细菌最终会被系统清除，但与嗜中性粒细胞减少条件相比，美罗培南在免疫健全条件下对CFU的减少贡献较低。数据不支持美罗培南在免疫细胞内的作用。在模拟的剂量范围研究和剂量分级研究中，阐明了剂量-反应梯度对免疫状态的依赖性。预测最高剂量或最频繁给药方案下，嗜中性粒细胞减少条件下的细菌计数至少与免疫健全条件一样低，而在嗜中性粒细胞减少条件下预测仅能达到停滞或生长的剂量，在免疫健全条件下预测可实现杀灭。

在剂量分级研究中，频繁给药被预测为给定总剂量下最有效的方案，fT_>MIC被确定为相关性最高的PK/PD指数，这与先前关于美罗培南的报道一致。然而，在免疫健全条件下，与其他给药方案相比，细菌计数的差异不那么明显，这影响了预测的抗生素对PK/PD指数值的疗效。在免疫健全小鼠中，fT_>MIC≈40%时即可达到近最大的细菌计数减少，而在嗜中性粒细胞减少小鼠中，当fT_>MIC从40%增加到80%时，预测还会额外减少约2 log。因此，如果在嗜中性粒细胞减少或免疫健全条件下进行剂量分级研究，衍生的疗效靶标预计会不同。值得注意的是，对于所研究的菌株，由于预测免疫健全对照组在26小时时的细菌计数低于停滞线，因此靶标需要根据不同于嗜中性粒细胞减少条件的标准进行调整。总体而言，这些结果表明，关于抗生素疗效和剂量选择的结论在嗜中性粒细胞减少和免疫健全小鼠感染模型之间可能不同。在免疫健全小鼠中进行的研究可能有助于深入了解具有不同免疫状态的患者群体之间的疗效差异，并增进对不同抗生素如何依赖免疫系统的理解。作为展望，使用不同类型免疫缺陷模型（如SCID、NOD或gammac小鼠模型）的体内研究可能会进一步揭示抗生素和免疫系统如何相互作用。

所开发的模型存在一些局限性。基于现有数据无法量化免疫应答的饱和，这可能需要使用几种细菌接种量进行扩展研究。此外，与连续函数相比，依赖于组的吞噬速率限制了外推到未研究条件的能力。由于只研究了一种细菌菌株，需要对其他菌株或物种进行进一步探索以增强模型的稳健性。

总之，本研究确定了美罗培南在嗜中性粒细胞减少和免疫健全小鼠感染模型中的PK差异，并量化了在具有不同程度免疫抑制的小鼠肺部感染模型中免疫应答和美罗培南对细菌的杀伤作用。研究发现美罗培南在免疫健全条件下对细菌杀伤的贡献降低，这归因于受美罗培南影响的细菌比例较低。模拟表明，抗生素PKPD分析的结果（例如从PK/PD指数衍生的PK/PD靶标）将因使用免疫健全或嗜中性粒细胞减少感染模型而异。

ACKNOWLEDGMENTS

本项目获得了欧盟地平线2020研究和创新计划玛丽·居里资助协议编号861323以及瑞典研究理事会资助编号2022-00657的支持。