破解耐药难题：新型β-内酰胺酶抑制剂Pilabactam（ANT3310）联合美罗培南高效对抗产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Disarming carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii: high potency of the novel therapeutic combination of meropenem and the innovative diazabicyclooctane β-lactamase inhibitor pilabactam (formerly ANT3310)

本文研究了新型二氮杂双环辛烷类β-内酰胺酶抑制剂Pilabactam（PIL）与美罗培南（MEM）联合用药对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）的作用。研究证实MEM/PIL组合在体外对包括难抑制的D类碳青霉酶（CHDL）在内的多种β-内酰胺酶具有优异活性，能显著恢复美罗培南的抗菌效能，且在临床菌株中显示出低的耐药突变率。通过酶动力学和分子动力学模拟，揭示了Pilabactam通过氟原子与OXA-23酶活性位点形成独特稳定相互作用的高效抑制机制。

　　

INTRODUCTION

鲍曼不动杆菌是一种主要的医院感染病原体，常导致免疫低下或危重患者的危及生命的感染。世界卫生组织已将碳青霉耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）列为关键优先病原体。CRAB的耐药性主要由获得性D类碳青霉酶（CHDLs）如OXA-23、OXA-24/40和OXA-58驱动，导致治疗选择极其有限。尽管已有一些新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合，如舒巴坦/度洛巴坦（SUL/DUR）和头孢地尔（FDC），但它们各自存在局限性。Pilabactam（PIL，前称ANT3310）是一种新型二氮杂双环辛烷类抑制剂，其特点是将阿维巴坦的酰胺基替换为氟原子，从而扩展了对包括CHDLs在内的丝氨酸β-内酰胺酶的抑制谱。本研究旨在全面评估MEM/PIL组合对CRAB的活性、耐药选择倾向及其作用机制。

RESULTS AND DISCUSSION

MEM/PIL exhibits potent activity against A. baumanniirecombinant strains producing serine β-lactamases

为了评估Pilabactam在鲍曼不动杆菌中的抑制效力和谱系，研究构建了15株分别表达不同临床相关β-内酰胺酶的等基因转化株。结果表明，美罗培南对产碳青霉酶的转化株最低抑菌浓度（MIC）显著升高。而MEM/PIL组合对所有产丝氨酸β-内酰胺酶的转化株均表现出强大的活性，MIC值均处于敏感范围内且不超过1 mg/L。其中，对产KPC-3、OXA-24/40和OXA-143酶的菌株MIC降低最为显著（分别降低256倍、256倍和>512倍）。Pilabactam恢复美罗培南活性的能力与度洛巴坦（DUR）相当。与舒巴坦/度洛巴坦组合相比，美罗培南本身对鲍曼不动杆菌具有更高的内在抗菌活性，这归因于其对青霉素结合蛋白（PBPs）更广的结合谱和更高的酰化速率。

Pilabactam overcomes meropenem resistance in clinical A. baumanniistrains producing CHDLs

研究测试了68株来自2020年西班牙全国监测的、经全基因组测序的CRAB临床分离株对MEM/PIL的敏感性。所有菌株对美罗培南耐药（MIC₅₀/MIC₉₀为32/64 mg/L）。而MEM/PIL组合表现出显著增强的活性，MIC₅₀/MIC₉₀值分别为1和2 mg/L，所有菌株在≤2 mg/L时被抑制，敏感率达100%。这表明Pilabactam能将美罗培南对CRAB的活性提高多达32倍。舒巴坦/度洛巴坦组合也表现出显著的活性（MIC₅₀/MIC₉₀同为1/2 mg/L），但度洛巴坦对舒巴坦的增效作用（MIC降低8倍）弱于Pilabactam对美罗培南的增效作用。头孢地尔虽在体外活性最高，但其临床疗效仍存争议。

MEM/PIL shows a low propensity of development of resistance

在四个代表性的产CHDL（OXA-23或OXA-24/40）临床CRAB分离株中进行了自发耐药频率研究。在浓度达到4倍MIC时，未筛选出对MEM/PIL耐药的突变体，耐药频率低于1.2 × 10^?9。所有菌株的防突变浓度均≤4倍MIC。这表明MEM/PIL在治疗CRAB感染时产生耐药的风险较低。

Kinetic characterization of pilabactam and durlobactam against the OXA-23 CHDL

通过酶动力学方法详细比较了Pilabactam和Durlobactam对OXA-23的抑制效力。两者均表现出高二级速率常数和低解离常数，表明能形成强效且持久的酶-抑制剂复合物。Pilabactam的二级速率常数（k_inact/K_I）为16.9 × 10³M^?1s^?1，显著高于阿维巴坦（约60倍），也高于Durlobactam（3.5 × 10³M^?1s^?1）。Pilabactam的抑制过程符合两步、慢紧密结合机制。两者均表现出低纳摩尔级的平衡解离常数（K_d），Pilabactam的K_d值（4.1 nM）约为Durlobactam（9.9 nM）的一半。两者的解离速率常数（k_off）均非常低，对应的半衰期（t_1/2）分别为171分钟和337分钟，表明抑制后β-内酰胺酶活性恢复极其缓慢。对OXA-24/40酶的动力学分析也显示，Pilabactam形成共价加合物的速率显著高于阿维巴坦（约20倍）。

In silicobinding mode analysis reveals key differences in pilabactam and durlobactam interactions with OXA-23

通过分子对接和动力学模拟研究了Pilabactam、Durlobactam和阿维巴坦与OXA-23的结合模式。OXA-23的活性位点是一个由M213和F102侧链构成的高度疏水性的隧道样结构。模拟显示，当催化赖氨酸K73处于非羧化形式时，抑制剂能稳定地停留在活性位点。Pilabactam通过其硫酸基团与R250、S118、T209和K208等残基形成静电和氢键相互作用，其羰基与催化丝氨酸S70和W211的主链NH基团（氧阴离子孔的一部分）形成氢键。至关重要的是，Pilabactam结构中的氟原子与活性位点隧道入口处的关键残基形成了独特的相互作用：通过一个水分子与W157（Ω-环）的NH基团形成强氢键，并与V120和L158（Ω-环）的侧链形成多种C-H···F相互作用。这些相互作用将Pilabactam牢固地锚定在催化位点，使其易于受到丝氨酸亲核攻击。相比之下，阿维巴坦在模拟中逐渐远离催化丝氨酸，无法形成稳定的、有利于失活的构型。Durlobactam则能稳定结合，其甲基与M213之间存在C-H···S相互作用，其伯酰胺基团通过水介导的氢键与D214相互作用。由于氟原子更小、更紧凑，Pilabactam能够比Durlobactam更深地插入催化裂隙，这可能是其实验观察到的更快形成酰基-酶加合物的原因。

CONCLUSIONS

本研究全面证明了Pilabactam能有效恢复美罗培南对CRAB的活性。在等基因菌株和临床CRAB分离株中，MEM/PIL组合均表现出强大效力，且耐药选择倾向低。酶动力学分析证实Pilabactam对OXA-23具有强效抑制活性。分子动力学模拟揭示了Pilabactam中氟原子的关键作用：其通过与OXA-23活性位点隧道入口处残基（V120、L158、W157）形成独特的氢键和C-H···F相互作用，实现了高效、稳定的结合。MEM/PIL组合是目前治疗鲍曼不动杆菌感染最有前景的在研疗法之一，这些结果有力支持该组合继续推进临床试验。